TEMA 1 - Introducción (técnicas) Flashcards
¿Entre qué carbonos ocurre el enlace fosfodiéster en el DNA?
entre el hidroxilo (OH) del C3’ de la desoxirribosa del primer nucleótido y el hidroxilo del grupo fosfato del C5’ del otro nucleótido.
¿Qué azúcar y bases se pueden encontrar en un nucleósido de DNA? ¿Cómo están unidos?
- Nucleósido:
- Base nitrogenada: purina (adenina, A; y guanina, G) o
pirimidina (citosina, C; y timina, T) unida al C1 ́de la
ribosa mediante enlace N-glucosídico. - Azúcar: 2 ́- Deoxy-D-ribosa
¿En qué sentido se escriben las cadenas de DNA?
Las cadenas de DNA empiezan con un grupo 5’-fosfato (5’- P) en un extremo y
un 3’-hidroxilo en el otro. Se escriben siempre en dirección extremo 5’ (izquierda) al extremo 3’ (derecha).
¿Cómo es la doble hélice que forman dos cadenas de DNA?
dextrógira
La hélice del DNA se estabiliza por dos tipos de interacciones:
- Apareamiento de bases: formación de puentes de hidrógeno entre bases complementarias de las dos cadenas.
- Apilamiento de bases: fuerzas de van der Waals entre bases adyacentes.
¿A qué longitud de onda tiene abs máxima los ácidos nucleicos?
Los ácidos nucleicos, incluyendo el DNA, tiene una absorbancia máxima a 260nm que permite cuantificarlos por medida de absorbancia y calcular el grado de purificación. En el espectro esta medida esta cerca de la de las proteínas 280’nm con la que puedo calcular la contaminación proteica de mi muestra.
¿Qué es la Tm y de qué depende?
La temperatura de melting (Tm) es la temperatura a la cual la mitad de las moléculas del DNA están desnaturalizadas.
La Tm depende de:
* la composición en nt de la muestra: por el número de puentes de hidrogeno entre las bases.
* la concentración de sales en la solución.
¿Qué es el efecto hipercrómico?
Efecto hipercrómico: La desnaturalización del DNA también se puede analizar por cambios en el espectro de absorción. Ya que la cantidad absorbida en 260nm es distinta para la cadena sencilla o la doble cadena. por El DNA de cadena sencilla aumenta la absorbancia a 260nm, aun permaneciendo constante la cantidad de DNA.
Factores que desnaturalizan el DNA:
- Alta temperatura (no fisiológica): rompe puentes de hidrógeno (base-pairing) y reduce la estabilización hidrofóbica.
- Alto pH: crea una fuerte carga negativa en los grupos fosfodiéster produciendo repulsión de cargas entre las cadenas.
- Agentes caotrópicos: urea, formamida, formaldehído. Actúan sobre fuerzas no covalentes, alteran puentes de hidrógeno.
- Hidrólisis de los enlaces fosfodiéster (entre nucleósidos) o N-glucosídicos (en cada nucleósido).
¿Cómo se da la renaturalización?
Es necesario un enfriamiento lento gradualmente. Primero se asocian las bases complementarias de secuencias cortas al azar (slow nucleation) y posteriormente se alinean el resto de secuencias más rápidamente (zipping step).
Depende de la concentración.
¿Cuáles son los pasos generales en la extracción del DNA?
- Disgregación de tejidos o lisis celular y clarificación.
- Purificación (del DNA sobre el resto de la muestra) mediante precipitación o cromatografía.
- Concentración.
- Análisis cuantitativo y cualitativo
(electroforesis).
¿Qué métodos hay para la fragmentación de tejidos y lisis celular?
Rotura de las células preservando la molécula de DNA (el proceso en RNA es muy parecido pero hay que tener mucho más cuidado porque es más fácil que se disgregue).
Hay distintos métodos que depende del tipo de célula a lisar:
* Métodos físicos: Abrasión (beads), émbolos, sonicación, etc.
* Métodos químicos: Agentes disgregantes de la membrana plasmática, como detergentes (SDS).
* Métodos enzimáticos: Enzimas que degradan pared celular (lisozima en bacterias, liticasa en
levaduras).
¿Qué métodos hay para la clarificación/purificación?
Eliminación de restos insolubles por centrifugación.
Extracción con solventes orgánicos.
Precipitación
Columnas
¿Cómo se purifica el DNA mediante eliminación de restos insolubles por centrifugación
¿Cómo se purifica el DNA mediante extracción con solventes orgánicos?
¿Cómo se purifica el DNA mediante precipitación?
¿Cómo se purifica el DNA mediante columnas?
¿Cómo se extrae el DNA plasmídco mediante centrifugación en gradiente de densidad?
¿Cómo podemos cuantificar nuestro DNA?
¿Cómo puedes distinguir los diferentes estados de un DNA plasmídico mediante electroforesis en gel de agarosa?
Cuando el DNA es lineal migra según el tamaño, pero cuando el DNA es circular su migración va a depender del grado enrollamiento (mayor porcentaje de enrollamiento es más pequeño y migra más). La forma lineal se encuentra poco y suele ser porque el DNA se ha cortado.
¿Qué se espera ver si se hace electroforesis del RNA de una célula eucariota?
En el patrón del RNA se ve el RNA ribosomal (que es el mayoritario) de las dos subunidades. Si esta degradado no se ven dos líneas, se ve difuso.
¿En qué consiste la hibridación de ácidos nucleicos?
Annealing de dos moléculas de DNA (o RNA) monocatenarias y heterólogas (de diferentes fuentes, organismos) por complementariedad de bases total o parcial.
Implica la formación de híbridos: DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA.
- Permite la localización de secuencias específicas mediante el uso de sondas marcadas (probes) complementarias.
- La sonda hibridará en la región complementaria de un ssDNA (target).
- Incubación con la sonda por debajo de la Tm.
¿Qué son las condiciones de alta astringencia y baja astringencia?
¿Qué es un dotblot?
¿En qué consiste el Northern Blot?
¿En qué consiste el southern blot?
¿Qué es un microarray de DNA?
Consiste en la hibridación de una muestra de ácido nucleico (target) derivada de los mRNAs de células o tejidos, a secuencias de ssDNA (probes) que están inmovilizadas en una plataforma sólida (array).
- Permite medir el nivel de expresión de miles de estos fragmentos (mRNAs) de forma simultánea.
- Se cuantifica el nivel de hibridación de la sonda específica con la molécula target mediante
fluorescencia y a través de análisis de imagen.
Es un chip que tiene unos oligos fijados en la celda del gen que quiero ver.
- Extracción mRNA de las células tratadas o tejidos a comparar.
- Copia a cDNA mediante retrotranscripción con nt marcados con distintos fluoróforos (rojo,
verde).
- Las mezclas de cDNA son marcadas e hibridadas al mismo μ-array.
- Un scanner con láser determina la intensidad de fluorescencia para cada fluoróforo.
¿En qué consite la CHIP?
¿En qué consiste el CISH?
Hibridación in situ cromogénica. El marcaje de DNA (DISH) o RNA (RISH) se realiza con fosfatasa alcalina, o peroxidasa que permiten visualizar en microscopio normal de luz clara, por ejemplo, traslocación cromosómica en un tejido (muestra patológica).
Permite mantener la estructura del tejido intacta.
No utiliza fluorescencia utiliza reacciones enzimáticas como la peroxidasa, por lo que se puede ver el resto del tejido.
Por ejemplo, se podría ver la expresión de un gen de unas células específicas dentro de un tejido y ver en que zonas hay mayor expresión.
¿En qué consiste el DNA-FISH?
Se ha utilizado dos sondas (roja y verde) y mediante estos procesos de hibridación lo que hacemos es ver donde está localizado este gen en el genoma.
Se utiliza para por ejemplo la localización de un gen en el cromosoma. Hibridación in situ de dos secuencias repetitivas en el cromosoma en trigo silvestre.
¿En qué consiste el RNA-FISH?
Estudios de expresión génica en desarrollo. Sondas de RNA se marca con nucleótidos modificados con grupos amina que permiten su unión mediante reacción química (click chemistry) con fluoróforos.
RNA marcado que se utiliza en un embrión de Drosophila para analizar la expression de Krüppel (magenta) y de la proteína romboide (naranja). Ver el desarrollo de Drosophila.
