TEMA 1 - Introducción (técnicas) Flashcards
(42 cards)
¿Entre qué carbonos ocurre el enlace fosfodiéster en el DNA?
entre el hidroxilo (OH) del C3’ de la desoxirribosa del primer nucleótido y el hidroxilo del grupo fosfato del C5’ del otro nucleótido.
¿Qué azúcar y bases se pueden encontrar en un nucleósido de DNA? ¿Cómo están unidos?
- Nucleósido:
- Base nitrogenada: purina (adenina, A; y guanina, G) o
pirimidina (citosina, C; y timina, T) unida al C1 ́de la
ribosa mediante enlace N-glucosídico. - Azúcar: 2 ́- Deoxy-D-ribosa
¿En qué sentido se escriben las cadenas de DNA?
Las cadenas de DNA empiezan con un grupo 5’-fosfato (5’- P) en un extremo y
un 3’-hidroxilo en el otro. Se escriben siempre en dirección extremo 5’ (izquierda) al extremo 3’ (derecha).
¿Cómo es la doble hélice que forman dos cadenas de DNA?
dextrógira
La hélice del DNA se estabiliza por dos tipos de interacciones:
- Apareamiento de bases: formación de puentes de hidrógeno entre bases complementarias de las dos cadenas.
- Apilamiento de bases: fuerzas de van der Waals entre bases adyacentes.
¿A qué longitud de onda tiene abs máxima los ácidos nucleicos?
Los ácidos nucleicos, incluyendo el DNA, tiene una absorbancia máxima a 260nm que permite cuantificarlos por medida de absorbancia y calcular el grado de purificación. En el espectro esta medida esta cerca de la de las proteínas 280’nm con la que puedo calcular la contaminación proteica de mi muestra.
¿Qué es la Tm y de qué depende?
La temperatura de melting (Tm) es la temperatura a la cual la mitad de las moléculas del DNA están desnaturalizadas.
La Tm depende de:
* la composición en nt de la muestra: por el número de puentes de hidrogeno entre las bases.
* la concentración de sales en la solución.
¿Qué es el efecto hipercrómico?
Efecto hipercrómico: La desnaturalización del DNA también se puede analizar por cambios en el espectro de absorción. Ya que la cantidad absorbida en 260nm es distinta para la cadena sencilla o la doble cadena. por El DNA de cadena sencilla aumenta la absorbancia a 260nm, aun permaneciendo constante la cantidad de DNA.
Factores que desnaturalizan el DNA:
- Alta temperatura (no fisiológica): rompe puentes de hidrógeno (base-pairing) y reduce la estabilización hidrofóbica.
- Alto pH: crea una fuerte carga negativa en los grupos fosfodiéster produciendo repulsión de cargas entre las cadenas.
- Agentes caotrópicos: urea, formamida, formaldehído. Actúan sobre fuerzas no covalentes, alteran puentes de hidrógeno.
- Hidrólisis de los enlaces fosfodiéster (entre nucleósidos) o N-glucosídicos (en cada nucleósido).
¿Cómo se da la renaturalización?
Es necesario un enfriamiento lento gradualmente. Primero se asocian las bases complementarias de secuencias cortas al azar (slow nucleation) y posteriormente se alinean el resto de secuencias más rápidamente (zipping step).
Depende de la concentración.
¿Cuáles son los pasos generales en la extracción del DNA?
- Disgregación de tejidos o lisis celular y clarificación.
- Purificación (del DNA sobre el resto de la muestra) mediante precipitación o cromatografía.
- Concentración.
- Análisis cuantitativo y cualitativo
(electroforesis).
¿Qué métodos hay para la fragmentación de tejidos y lisis celular?
Rotura de las células preservando la molécula de DNA (el proceso en RNA es muy parecido pero hay que tener mucho más cuidado porque es más fácil que se disgregue).
Hay distintos métodos que depende del tipo de célula a lisar:
* Métodos físicos: Abrasión (beads), émbolos, sonicación, etc.
* Métodos químicos: Agentes disgregantes de la membrana plasmática, como detergentes (SDS).
* Métodos enzimáticos: Enzimas que degradan pared celular (lisozima en bacterias, liticasa en
levaduras).
¿Qué métodos hay para la clarificación/purificación?
Eliminación de restos insolubles por centrifugación.
Extracción con solventes orgánicos.
Precipitación
Columnas
¿Cómo se purifica el DNA mediante eliminación de restos insolubles por centrifugación
¿Cómo se purifica el DNA mediante extracción con solventes orgánicos?
¿Cómo se purifica el DNA mediante precipitación?
¿Cómo se purifica el DNA mediante columnas?
¿Cómo se da la extracción del DNA en plantas?
MÉTODO CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
Esta molécula se agrega a un extracto celular de plantas que forma un complejo con los ácidos nucleicos y precipita.
Carbohidratos, proteínas y otros contaminantes quedan en sobrenadante.
Posteriormente se separa con compuestos orgánicos.
Se incuba con 1M NaCl para romper el complejo y se precipita el DNA con etanol.
¿Qué métodos hay para extraer DNA plasmídico?
Lisis alcalina
Centrifugación en gradiente de densidad.
¿Cómo se extrae el DNA plasmídco mediante lisis alcalina?
En condiciones de pH alcalino, el DNA no superenrollado de la bacteria se desnaturaliza y el plasmídico no. A pH 12.0-12.5 se desnaturaliza el DNA bacteriano y al volver a condiciones ácidas se forman agregados.
Esto nos sirve porque cuando introducimos un plásmido en una bacteria tenemos DNA plasmídico y DNA bacteriano. Los plásmidos son moléculas muy estables por lo que se hace una lisis alcalina provocando la desnaturalización del DNA (principalmente del DNA bacteriano).
Si a su vez hemos lisado las células con SDS y neutralizado con acetato sódico, el RNA y las proteínas celulares también precipitan, quedando en el sobrenadante solamente el DNA plasmídico.
EDTA:
- Quelante de los iones necesarios para la actividad de las enzimas.
- Desestabiliza la pared celular
SDS:
- Rompe la membrana celular/pared celular
- Desnaturaliza las proteínas
NaOH:
- Desnaturaliza el DNA genómico y plasmídico
- Degrada el RNA
Cuando se vuelve al pH antes el DNA va a precipitar (el desnaturalizado), ya que el superenrollado (plasmídico) se queda arriba. Finalmente utilizamos columnas de membrana de sílice (que como solo tenemos el DNA del plásmido, es el que se va a unir al sílice). También se utilizan los gradientes de cloruro de cesio en una centrifugación en gradiente de densidad.
¿Cómo se extrae el DNA plasmídco mediante centrifugación en gradiente de densidad?
¿Cómo podemos saber a pureza de nuestro DNA?
Ratio A260/A280 < 1.8: posible contaminación con proteínas y/o sustancias aromáticas (como fenol).
Ratio A260/A280 > 1.8: posible contaminación con RNA.
A260/A280 óptimo: 1,8-2,0.
Ratio A260/A230: pureza respecto a compuestos orgánicos (debe estar entre 1,8-2,2).
¿Cómo podemos cuantificar nuestro DNA?
¿Cómo puedes distinguir los diferentes estados de un DNA plasmídico mediante electroforesis en gel de agarosa?
Cuando el DNA es lineal migra según el tamaño, pero cuando el DNA es circular su migración va a depender del grado enrollamiento (mayor porcentaje de enrollamiento es más pequeño y migra más). La forma lineal se encuentra poco y suele ser porque el DNA se ha cortado.
