Tema 3. Incorporación de aas no naturales (UAA) Flashcards
¿Cuál es el objetivo de incorporar aas no naturales?
Introducir un aa no natural (no existente en la naturaleza, pero que podemos sintetizarlo de forma química, y al que se le pueden dar muchas aplicaciones) en una proteína. Por ejemplo, una Lys modificada con un anillo aromático que le aporte fluorescencia
Para poder llevarlo a cabo es necesario conocer el sistema de síntesis proteica, donde tienen un papel clave las aminoacil-tRNA sintetasas (que poseen un código propio para identificar tRNA con el aa correspondiente, hablamos de un subcódigo genético), los tRNA y los ribosomas (para sintetizar proteínas)
¿Cómo intervienen las aminoacil-tRNA sintetasas en la incorporación de aas al tRNA?
Las aminoacil-tRNA sintetasas son las que realmente definen y reconocen el código genético, ya que se encargan de incorporar cada aa a su tRNA correspondiente. Es lo que realmente vamos a manipular para introducir un elemento que no existe en la naturaleza
Existen entre 20 y 21 tRNA sintetasas, cada una con un bolsillo característico, una serie de dominios evolucionados en los cuales se introduce un aa determinado, que viene determinado por la secuencia de nucleótidos (1tRNA -> 1 aa). También presenta otro bolsillo para el ATP
Además, si observamos el código genético, nos damos cuenta de que cada aa suele estar codificado por más de un codón, por lo que cada sintetasa puede reconocer varios tRNA
El proceso de incorporación del aa al tRNA ocurre en el centro de acilación o síntesis
La reacción que catalizan se puede dividi r en dos fases:
1) Activación del aa; la sintetasa tiene un bolsillo en la que se acomoda el aa, y otro en el que entra un ATP activo y fácilmente atacable… Para ello, el grupo -COOH del aa ataca al fosfato alfa del ATP (se libera PPi). Formándose el intermedio 5’-aminoacil adenilato. El intermedio no abandona la enzima, sino que se queda unido por interacciones no covalentes
2) Incorporación al tRNA. El aa-AMP (5’-aminoacil adenilato) interacciona con el OH de la adenina del extremo 3’ CCA que se encuentra en el tallo aceptor del tRNA, liberando AMP y generando el aminoacil-tRNA
3) Unión de un factor protector al aminoacil-tRNA, el cual evita su degradación hasta llegar al ribosoma y ejercer su función
Hay dos clases de aminoacil-tRNA sintetasas:
a) Monómero, transfieren el grupo aminoacilo al OH-2’ de la adenina del tRNA, y luego hacen una transesterificación para trasladarlo al OH-3’
b) Dímero, transfieren el grupo aminoacilo directamente al OH-3’ del residuo 3’-A del tRNA produciéndose el aminoacil-tRNA
En ambos el resultado es el mismo, la unión del aa al OH del carbono 3 de la A que se encuentra en el tall aceptor
¿Cuál es la estructura de las sintetasas?
1) Un bolsillo para reconocer el aa (muy específico), que será el centro de reacción
2) Un bolsillo para reconocer el ATP
3) Un bolsillo para reconocer el tRNA (el tRNA debe tener su 3’-CAA cerca del centro de síntesis, y su anticodón debe estar en una región de reconocimiento que es el que otorga especificidad para reconocer unos tRNA y no otros)
La mayoría de tRNA sintetasas tienen otro centro activo además del de síntesis o acilación: el centro de edición para evitar que entren aas incorrectos, en él se produce un cambio conformacional que evita la entrada de aas más pequeños como alanina. La tRNA sintetasa que incorpora Cys no tiene este centro de edición, por lo que es una buena elección para realizar ingeniería de proteínas, pues no rechaza la incorporación de un aa no natural. Sin embargo, las sintetasas que incorporan aas muy diferentes a cualquier otro no necesitan el centro de edición, basta con el centro de acilación para discriminarlo.
La hipótesis de balanceo establece que puede haber as que se pueden codificar hasta por 6 tripletes, y otros tan solo por 1 ó 2. Cuando, para un aa, el sistema puede reconocer más de un codón, es la última base del triplete la que suele variar. Esto se debe a que la 3ª base del anticodón no interacciona tan específicamente con la correspondiente en el codón. La base que se encuentre en esta posición de balanceo determina el nº de codones que puede reconocer un solo tRNA
Tenemos 20-21 tRNA sintetasas pero tRNA tenemos muchísimos, hasta 246
El codon usage: el porcentaje de uso de cada codón es diferente según la especie (por ejemplo, quizás los humanos usamos UGA como codón STOOP un 80% de las veces, pero E.coli lo usa tan solo un 3%). El saber con qué especie se trabaja es fundamental al trabajar en procesos de mutagénesis como la incorporación de UAA
¿Cómo es el proceso de síntesis de proteínas?
Tras formar el complejo de síntesis (2 unidades ribosomales + mRNA + met-tRNA), lo que debe ocurrir es la incorporación del siguiente tRNA según el código de tripletes del mRNA
Los tRNA entrantes van unidos a distintos factores de elongación (EF), que son del tipo proteico y trabajan con GTP y GDP. En concreto, EF-Tu sirven para evitar la hidrólisis natural del aa del tRNA. Una vez dentro del ribosoma, se hidroliza el GTP y se libera el EF, quedando el tRNA-aa desnudo dentro del ribosoma, en la zona A
En el ribosoma hay una zona en la que tiene lugar la formación del enlace peptídico. La subunidad mayor tiene varios nucleótidos que participan directamente en la formación del enlace peptídico. La proteína en formación estará en el tRNA del sitio A
Ahora hay que dejar el sitio A libre para que entre el siguiente aa-tRNA. Para ello, el factor de elongación G (EF-G) actúa como una palanca para arrastrar los tRNA a la siguiente posición (el de P pasa a E, y el que estaba en A pasa a P).
El ribosoma tiene un canal en la parte superior por donde sale el péptido. Tras la salida tendrá lugar su plegamiento (a veces con la actuación de chaperonas) y otras modificaciones postraduccionales
Una vez que llegamos al STOP, aparece el RF (factor de terminación), de naturaleza proteica aunque similar a la estructura 3D del tRNA. Actúa como una cuña, añade una molécula de agua y tiene lugar la hidrólisis del enlace peptídico entre la proteína y el tRNA del sitio P: se produce la liberación de la proteína
¿Qué son los aminoácidos no naturales (Unnatural Aminoacid, UAA)
Son aas que no son codificados por código genético, no existen en la naturaleza. Tienen la estructura típica de un aa pero cambia el radical, que está modificado, puede ser un grupo capaz de emitir fluorescencia o un grupo reactivo
Tampoco existe tRNA sintetasas que los incorporen por lo que tendremos que fabricarlas también mediante ingeniería genética
Para expandir el código genético y crear proteínas con aa no naturales, necesitamos:
1) El aa no natural: debe ser un aa modificado en su cadena lateral, que es la que más interviene en el reconocimiento. Se suele trabajar dentro de E. coli u otros sistemas naturales típicos de ingeniería de proteínas, por lo que debe ser permeable a las células que voy a utilizar o que lo biosinteticen de forma recombinante
- mRNA con un codón único y específico: se suelen usar codones STOP, porque no codifican ningún aa. Hay 3 codones STOP, la elección de uno u otro depende del organismo con el que estemos trabajando: nos fijamos en el codon usage, vemos cuál es el codón de parada que utiliza normalmente, y nosotros usamos alguno de los otros 2, para evitar así la competitividad entre el STOP y nuestro aa. Debido a la competitividad, es posible que la proteína se trunque por la entrada del factor de liberación cuando no deba
Para crear el mRNA se hace forma recombinante: colocamos en un plásmido (detrás de un promotor) la secuencia de DNAS que codifique la proteína de interés pero que incluya un codón para el aa modificado (UAA o el que sea que hayamos elegido según la especie con la que trabajemos).
Tras la transcripción, se obtendrán muchas copias de mRNA con el codón que codifica nuestro aa modificado
- Correspondiente iso-tRNA (iso-tRNA es el tRNA con el anticodón complementario al codón que hemos decidido que codificará nuestro aa modificado). Debemos modificar un tRNA para que su anticodón sea complementario al codón que hemos decidido que codifica nuestro aa. Para crear el iso-tRNA. se suele usar un plásmido lineal que contenga la secuencia del tRNA. Por lo general, modificaremos el tRNA para que tenga el anticodón complementario a un STOP (UGA, UAG o UAA), por eso se le suele llamar tRNA supresor o tRNAsb
- Correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa. Debemos modificar la aminoacil-tRNA sintetasa para que sea capaz de reconocer el aa modificado y al iso-tRNA. Si esta sintetasa tiene sitio de edición, es necesario eliminarlo mediante ingeniería genética.
El proceso de incorporación de aminoácidos modificados se puede realizar in vitro, pero tiene poca eficacia, así que solamente lo vamos a ver para demostrar que es posible introducir UAAs en proteínas usando tRNAs con anticodones modifcados
Si queremos conseguir grandes cantidades de producto debemos hacerlo in vivo usando un huésped (bacterias, levaduras, plantas, insectos, células de mamífero…). Hay que tener en cuenta que E. coli no introduce modificaciones post-traduccionales, por lo que se suelen utilizar levaduras para realizar este proceso
¿Cosas a tener en cuenta a la hora de incorporar sitio-específicamente un aa no natural en un sistema de traducción in vitro?
Este es el primer ejemplo que se hizo para poder demostrar que se podía introducir un aa no natural dentro de una proteína. Necesitamos:
1) Un plásmido lineal de DNA que codifique nuestro tRNA modificado (iso-tRNA o tRNAsb). Este tRNA tendrá un anticodón diferente al de cualquier otro tRNA, para que nuestro aa no natural no compita contra aa naturales. Generalmente se le pone un anticodón complementario al codón de STOP menos utilizado por la especie que utilizamos (UAA, UAG o UAGA)
- Un aa modificado, que será ligado a nuestro tRNA de forma química. Está marcado con una sonda fluorescente para detectarlo
- Un plásmido circular que contenga el gen que codifica el mRNA modificado de la proteína de interés. Mediante mutagénesis dirigida modificamos un codón de la secuencia del gen para que complemente con el anticodón de nuestro tRNA que portará el aa no natural. De este modo, en la posición modificada será donde se introduzca el aa no natural en lugar de uno natural
En la mayoría de los casos (en un % muy elevado) el codón STOP de nuestro mRNA será reconocido por nuestro tRNA, incorporando el aa no natural a la secuencia de la proteína en formación. Mediante diversas técnicas podemos analizar la proteína resultante y determinar si el experimento ha sido exitoso y el aa no natural se ha incorporado a nuestra proteína
Cosas a tener en cuenta
a) El UAA debe ser metabólicamente estable (para no convertirse en algo distinto a lo que queramos) y tener buena biodisponibilidad celular (que no sea tóxico). Debe ser permeable a la célula (ser capaz de atravesar la membrana o pared celular)
Además, debe ser reconocido por EF-Tu y el ribosoma, y no ser sustrato de ninguna sintetasa endógena (ya que si no competiría con otros aa naturales). Aun así, los aa no naturales suelen ser más grandes que los normales, por lo que no suelen caber en los bolsillos de las sintetasas endógenas. Por último, los grupos reactivos (amino y carboxilo) no se pueden modificar, lo que se debe cambiar es la cadena lateral R
B) El codón que diseñe debe ser reconocido solamente por nuestro iso-tRNA y no por tRNAs endógenos, ya que si no podría poner cualquier otro aa distinto de nuestro aa no natural en esa posición. Es fácil de conseguir eligiendo un codón de Stop y diseñando un iso-tRNA con el anticodón complementario , que competirá contra el factor de liberación RF
c) El par sintetasa/tRNA debe ser específico para nuestro aa no natural, funcional en el huésped (es decir, que funcione correctamente) y ortogonal en el contexto de todos los pares sintetasa/tRNA endógenos (es decir, que no se confunda con ningún otro elemento natural del sistema). Este punto es el más complicado de conseguir, y se hace usando un par ortogonal que sea lejano evolutivamente a levadura
¿Más conceptos a tener en cuenta?
a) Un par ortogonal sintetasa/iso-tRNA (aaRS/iso-tRNA) es un par constituido por una sintetasa modificada que reconozca el aa modificado y un tRNA también modificado (iso-tRNA). Este par debe ser específico para nuestro aa modificado y no presentar reactividad cruzada con otros pares aaRS/iso-tRNA (que nuestra sintetasa no reconozca tRNA endógenos y que nuestro iso-tRNA no sea reconocido por sintetasas endógenas). Esta es la razón por la cual se usa un par ortogonal de un organismo lejano evolutivamente al que utilicemos en nuestro experimento (normalmente lejano a la levadura que es el que más se usa en estos experimentos)
b) El CodónBL o codón blanco es un codón que no codifica un aa natural, y lo usaremos para que codifique nuestro aa no natural (en nuestro caso, será un codón Stop). A este codón se unirá nuestro iso-tRNA e incorporará el aa no natural en esa posición
c) tRNAsb (tRNA supresor): tRNA que complementa con el codónBL (será nuestro iso-tRNA). Se le llama supresor porque complementa con el codón Stop, el cual es supresor de la traducción (detiene la traducción en condiciones normales), no significa que nuestro tRNA suprima nada (todo lo contrario, sustituye al Stop)
¿Cómo se elige el par aaRS/tRNAsb?
Para buscar un par ortogonal adecuado (por definición, específico para nuestro aa) lo que se suele hacer es trabajar con pares heterólogos de especies lejanas a la especie con la que trabajamos, para evitar la confusión del propio sistema celular entre nuestra sintetasa y tRNA y las sintetasas y tRNA endógenas (por ejemplo, usar un par heterólogo de arquea si trabajamos con E. coli, ya que las sintetasas y tRNA de arqueas son algo distintas de las de E. coli, y evitan la confusión, aumentando la especificidad y el rendimiento)
¿Cómo se optimiza el par aaRS/tRNAsb?
Mejoramos la especificidad de nuestro sistema mediante un proceso de selección en dos pasos para identificar tRNAsn funcionales que no sean reconocidos por sintetasas endógenas (que no haya reactividad cruzada). Del mismo modo, usaremos mutagénesis dirigida y una estrategia de selección en dos pasos para alterar la especificidad de la sintetasa heteróloga para que únicamente reconozca el aa de interés y nuestro iso-tRNA
En otras palabras, lo que hacemos es coger la sintetasa y tRNA de una especie alejada, y las modificamos para que el tRNA no sea reconocido por sintetasas endógenas y complemente con el codón Stop (modificamos su anticodón y le ponemos el complementario al Stop), y la sintetasa reconozca únicamente a nuestro tRNA y nuestro aa no natural (modificando los aa de su bolsillo)
¿Proceso de incorporación de UAA en bacterias?
En E. coli. El objetivo final es que una E. coli sintetice una proteína en la que en X posición en vez de Tyr (por ejemplo) habrá una Tyr con un grupo fluorescente (esta Tyr modificada será nuestro UAA)
Necesitamos introducir en una bacteria un plásmido que sintetice un tRNA modificado y una sintetasa modificada
Como hemos dicho antes, tenemos que hacer los siguientes pasos:
- Importar un par aaRS/tRNASsb desde arquea o eucariota (alejados evolutivamente)
- Mutar el anticodón para generar nuestro tRNAsb que reconoce el Stop. Es fácil de crear: determinamos su secuencia, modificamos el anticodón e introducimos la secuencia modificada en un plásmido
- Hacer mutagénesis y selección para mejorar la ortogonalidad del par importado, aumentar su especificidad y disminuir la reactividad cruzada con pares endógenos.
Nos ponemos en situación: ya hemos creado nuestro iso-tRNA, y hemos introducido su secuencia en un plásmido. Para mello, hemos mutado un tRNA de un par aaRS/iso-tRNA de una especie lejana (en este caso, una arquea) para que no sea reconocido por ninguna sintetasa endógena, y que además, sea capaz de reconocer el Stop. Esto ha sido fácil ya que conocemos la estructura y secuencia del tRNA, y sabíamos exactamente en qué bases había que producir la mutagénesis
Ahora debemos mutar la sintetasa del par aaRS/tRNA de la especie alejada para que reconozca nuestro UAA. Para ello, conocemos la estructura 3D y la secuencia de la sintetasa, por lo que debemos mutar los aa del bolsillo en el que debe entrar nuestro aa no natural. Hasta aquí es un diseño raciona. El problema ahora es que sabemos qué aas hay que mutar, pero no cómo. Por ello pasamos a un diseño aleatorio: vamos cambiando cada aa del bolsillo por uno de los otros 19 posibles, y así generamos una genoteca o librería de miles de plásmidos (cada plásmido contiene la secuencia de la sintetasa con una mutación determinada)
El objetivo de este sistema (de reporteros) es encontrar cuál de todas las sintetasas mutadas de forma distinta (aaRS9 es capaz de reconocer nuestro UAA y nuestro tRNAsb. Necesitamos un sistema con muchas restricciones que nos permita seleccionar correctamente aquellas sintetasas que reconozcan nuestro aa y sean capaces de incorporarlo con un gran rendimiento. Solamente las colonias que sean capaces de expresar fluorescencia (480 nm) serán las seleccionadas y vamos a explicar por qué:
a) Plásmido que codifica el iso-tRNA y otros genes que ahora veremos cómo van a participar en el proceso de selección
b) Plásmido que codifica una de las millones de sintetasas mujtadas. Este plásmido contiene también un gen Kan’ que le confiere a E. coli defensa frente a la kanamicina (antibiótico) que añadiremos al medio posteriormente, de tal modo que solamente sobrevivirán en él las bacterias que alberguen ese plásmido (por selección positiva)
Los UAA del medio, al ser permeables, entran en las E. coli. Las bacterias que tengan la variante de sintetasa correcta incorporarán el UAA al iso-tRNA y en los ribosokmas se sintetizará nuestra proteína que incluirá el UAA en un punto de su secuencia
En el plásmido A hay un gen GFPuv que codifica una proteína verde fluorescente (GFP). La transcripción de este gen está controlada por un promotor T7L, por lo que la síntesis de GFP solamente tendrá lugar cuando también se haya sintetizado la polimerasa T7, cuyo gen se encuentra en el plásmido A
El gen que codifica la polimerasa T7 está interrumpido por un Codón BL: en dicha posición podrá incorporarse el UAA o ser STOP, si se reconoce como codón STOP, dará lugar a una proteína truncada. El UAA en la polimerasa T7 no ocasiona problemas en su actividad. Hay que tener en cuenta que el promotor de T7 debe de ser único y solo reconocido por la polimerasa T7 y no por ninguna otra polimerasa
¿Cuál es la primera fase de selección positiva?
La primera condición es que el iso-tRNA sea capaz de reconocer el codón UAA como un codón codificante, es decir, que no lo reconozca como STOP
Si E. coli tiene una variante de sintetasa que no reconoce el UAA, no será capaz de cargar a nuestro iso-tRNA, no se incorporará UAA en la secuencia, y el codón blanco actuará como STOP, por lo que no se sintetizaría la polimerasa T7 y, por tanto, la proteína GFP. No hay fluorescencia
Si la E. coli tiene una variante de sintetasa que reconoce el UAA, cargará nuestro iso-tRNA con él. El iso-tRNA incorporará el UAA en la posición de STOP, la polimerasa T7 podrá sintetizarse completamente, unirse al promotor T7 y permitir la síntesis de proteína GFP. Hay fluorescencia
Para aumentar la precisión del sistema, lo ideal es poner otra restricción: el medio contiene cloranfenicol, y en el plásmido hay un gen que codifica la resistencia a ese antibiótico. El gen, como el de la polimerasa T7, está interrumpido por un CodónBL. Solamente si la sintetasa reconoce el UAA y carga el iso-tRNA con él, se podrá sintetizar la resistencia al cloranfenicol. Si no pasa esto, el CodónBL actúa como STOP, no se desarrolla resistencia y E. coli muere por el cloranfenicol del medio
Tener en cuenta que nuestro aa ya aporta fluorescencia por sí solo por lo que tendremos un background de fluorescencia que se eliminará una vez purifiquemos la proteína
¿Cuál es la fase de selección negativa?
Segunda condición: una vez que sabemos cuál es el iso-tRNA que reconoce UAA y no el codón STOP, queremos saber cuál es la aaRS capaz de reconocer e incorporar nuestro UAA
Dentro de las E. coli que tienen fluorescencia (por GFP) y sobreviven al cloranfenicol (por la resistencia) existen falsos positivos:
Puede haber E. coli que tengan variantes de sintetasa que reconozcan aa naturales y carguen nuestro iso-tRNA con ellos incorporándolos en los codones BL, aportando funcionalidad tanto a la polimerasa T7 como a la proteína que aporta resistencia al cloranfenicol
Continuamos nuestro experimento trabajando solo con las bacterias que han dado positivo, es decir, con las que pueden colocar aa en los Codones BL, ya sea nuestro UAA (lo que buscamos) o un aa natural (falso positivo).
A estas bacterias les metemos un plásmido que sintetiza el gen suicida de la barnasa, una proteína tóxica que mata a E. coli. El gen de la barnasa tiene 3 codones BL en su secuencia, así que para que la bacteria sintetice la barnasa y muera debe colocar un aa en el codón BL
Si en un nuevo medio no añadimos el UAA (y solo añadimos los 200 aa naturales), los falsos positivos morirán (incorporarán algún aa natural en los codones BL, sintetizarán barnasa y morirán) y las bacterias con la sintetasa que queremos sobrevivirán (no pueden incorporar UAA porque no hay en el medio, así que los codones BL actúan como STOP, no se sintetiza barnasa y sobreviven). Lo que se está produciendo es que en aquellas colonias que sintetizan la barnasa la aaRS es capaz de reconocer e insertar un aa natural, mientras que aquellas colonias que tengan aaRS que solo reconoce e introduce el UAA producirán una proteína truncada pues no estamos incluyendo en el medio el UAA
Final: las E. coli que me queden las volveré a hacer pasar por el sistema para mejorar el resultado y que solo queden las E. coli con las mejores sintetasas (así elimino, por ejemplo, bacterias que hayan podido introducir dos plásmidos B con dos sintetasas distintas). Tras un par de ciclos, extraemos el plásmido B y comprobamos cuál es lka secuencia de RNA de la sintetasa óptima
En la actualidad existen miles de UAA, amplificando las posibilidades de usar proteínas para un fin adecuado, y la gran cantidad de fines que quedan por descubrir…¿
¿Cómo es el sistema en levaduras’
Existen proteínas, como las humanas, que deben ser provistas de modificaciones post-traduccionales u otros factores tras su síntesis. Las bacterias no tienen mecanismos de modificación post-traduccional, por lo que necesitamos un sistema más complejo, como levaduras, para la producción recombinante de esas proteínas. Cuando trabajamos con levaduras no se puede usar el sistema de antibióticos para seleccionar mutantes sino que debemos los requerimientos nutritivos
El punto de partida es el siguiente: el medio es auxótrofo para Leu y Trp y tampoco tiene uracilo (esencial en el metabolismo de nucleótidos). Las levaduras tienen:
a) Plásmido con GAL4(*), LEU2 (gen de síntesis de Leu) y URA3 8gen de síntesis de uracilo), cuya expresión está dirigida por el promotor SPO13
b) Plásmido con TRP1 (gen de síntesis de Trp), el tRNAsb y una de las miles de variantes de la librería de sintetasas (aaRS). Se utilizan tRNA y sintetasas procedentes de especies alejadas de la levadura, como E. coli
Las levaduras del cultivo son incapaces de sintetizar Trp y Leu por sí mismas, así que solo las levaduras que hayan incorporado los dos plásmidos podrán sobrevivir (es una selección equivalente a la de la kanamicina del ejemplo anterior con E. coli)
GAL4 es un factor de transcripción característico de levaduras. Tiene dos dominios: de activación (activa la transcripción) y de unión (unión al DNA). GAL4 se une al DNA y activa la transcripción
Selección positiva: al igual que antes, la 1ª condición es que el iso-tRNA sea capaz de reconocerr el codón UAA como un codón codificante, es decir, que no lo reconozca como STOP
No existe uracilo en el medio, así que las levaduras deben sintetizarlo para sobrevivir. El gen de síntesis de uracilo (URA3) está en el plásmido A y su expresión está controlada por el promotor SPO13, por lo que la síntesis de uracilo solo tendrá lugar cuando también se haya sintetizado el factor de transcripción GAL4 y este se una al promotor SPO13 activando la transcripción. El gen que codifica GAL4 está interrumpido por dos codones BL: en dicha posición podrá incorporarse el UAA o ser STOP
- Si la levadura tiene una variante de sintetasa que no reconoce el UAA, no será capaz de cargar a nuestro iso-tRNA, no se incorporará UAA en la secuencia y los codones BL actuarán como STOP, por lo que no se sintetizaría GAL4 y, por tanto, tampoco el Uracilo, cua consecuencia final será la muerte de la levadura al ser ésta incapaz de realizar la transcripción
- Si la levadura tiene una variante de sintetasa que reconoce el UAA, cargará nuestro iso-tRNA con él. El iso-tRNA incorporará el UAA en la posición de STOP, el factor GAL4 podrá sintetizarse completamente, unirse al promotor SPO134 y permitir la síntesis de uracilo. No muere.
Selección negativa: y al igual que en el caso anterior, tenemos una 2ª condición, y es que una vez que sabemos cuál es la iso-tRNA que reconoce UAA y no el codón STOP, queremos saber cuál es la aaRS capaz de reconocer e incorporar nuestro UAA
Dentro de las levaduras que sintetizan uracilo y sobreviven existen falsos positivos. Puede haber levaduras que tengan variantes de sintetasa que reconozcan aa naturales y carguen nuestro iso-tRNA con ellos. El iso-tRNA incorporará estos aa en los codones BL, por lo que sintetizará GAL4 y uracilo aunque esa sintetasa no sea específica para nuestro UAA
El procedimiento para realizar esta selección negativa es el siguiente: debemos retirar o prescindir e añadir el UAA al medio, e incorporar uracilo (para que crezcan todos), además, incluiremos 5FOA. El 5FOA es un compuesto que, en presencia de URA3, es degradado y se convierte en un producto tóxico para la célula.
En esta situación, las levaduras positivas sobrevivirán (no hay UAA en el medio, el codón blanco actúa como STOP, no sintetizan GAL4 y por tanto URA3) y las falsas positivas morirán (añaden aa naturales al codón BL, sintetizan GAL4 y, con ello URA3, que convertirá 5FOA en tóxico para la célula)
Final: como resultado, solamente tendremos vivas las levaduras que tengan una variante mutada de sintetasa capaz de incorporar específicamente UAA a nuestro iso-tRNA. Como en el ejemplo con las E. coli, tras varios ciclos, extraeremos el plásmido B de las levaduras vivas, y realizamos una secuenciación masiva
¿Cómo es el sistema en células de mamífero?
Las bacterias y las levaduras son fáciles de transformar (mediante plásmidos), mientras que en células de mamífero el sistema celular es mucho más complejo, y la eficiencia de transformación disminuye, existen bajos tiempos de duplicación y los precios de cultivo se disparan debido a las condiciones tan exquisitas de crecimiento. Estos sistemas actualmente se usan a modo de información, pues en mamíferos la probabilidad de éxito es muy baja
Existen problemas con la eficiencia de transformación, tiempo de duplicación celular, las condiciones de crecimiento y la estrategia de selección de dos pasos no es ideal para evolucionar aaRS con especificidades alteradas
Cuando lo que realmente se necesita es producir la proteína en mamíferos, lo que se hace es conseguir el par ortogonal aaRS/iso-tRNA de la mejor manera posible en bacterias y levaduras, y este par se transfecta a la célula de mamíferos sin pérdida de ortogonalidad. Las líneas celulares más usadas son CHO (ovario de hámster) y 293T (riñón de mono)
El sistema sería el siguiente: realizaríamos la 12ª fase de obtención del par ortogonal en E. coli y pasaríamos entonces a realizar la última vuelta en un sistema de mamífero para añadir modificaciones post-traduccionales en nuestro proteína para conseguir que sea funcional. Las células que mejor funciona en estos tratamientos son las de riñón humano
¿Qué son UAAs codificados genéticamente y cuáles son sus aplicaciones?
- La adición de grupos reactivos químicamente nos permite marcar proteínas sitio-específicamente in vitro, modificarlas intracelularmente u otorgarles nuevas o mejoradas funciones catalíticas o crear una proteína capaz de catalizar una reacción que antes realizaba un compuesto químico, ahora tenemos las ventajas de una enzima, como que no se consume
- Los UAA pueden ser usados en técnicas como IR, NMR, pruebas fluorescentes, agentes activos rédox, determinación de estructuras por rayos X, pruebas de puentes de H e interacciones en el plegado proteico
- Ingeniería de proteínas para generar nuevas funciones, lo cual podría ser todo un reto usando únicamente los 20 aa naturales
- La expresión de proteínas con modificaciones post-traduccionales (PMTs)
