Transgene Mausmodelle Flashcards
Ort der Genveränderung für temporäre oder permanente Generierung transgener Mäuse
temporär:
Gentransfer in somatische Zellen mit siRNA
permanent:
Gentransfer in die Keimbahn
Unterschied homologer/heterologer Gentransfer
homologer Gentransfer:
Das eingeschleuste Gen ist bereits im Organismus vorhanden
heterologer Gentransfer:
Einbau eines für den Organismus fremdes Gen
(z.B. humane Sequenz in Maus)
Wie wird zufällig, wie gezielt eingebaut?
zufälliger Einbau
Dominant-negative Inaktivierung bzw. transgene Überexpression
gezielter Einbau
durch homologe Rekombination
Durch welchen Einbau werden Knockout und Knockin Mäuse erstellt und was ist der Unterschied?
Durch homologe Rekombination.
Knockout (Loss of function):
❖ Mutation bzw. Deletion verhindert die weitere Expression des Ziel-Gens, es entsteht kein Proteinprodukt.
❖ Eine Knockout-Maus ist eine Maus, bei der mittels einer genetischen Manipulation (Gene-Targeting) gezielt ein oder mehrere Gene deaktiviert wurden (Gen-Knockout).
Knockin (Gain of function):
❖ Vermehrte Expression eines Gens durch Modulation von Expressionsregulatoren oder durch Einbau einer zusätzlichen Kopie in die DNA.
❖ Das Knock-in (auch Gen-Knock-in) bezeichnet in der Genetik Verfahren zur gezielten Insertion eines Transgens, d. h. eines zuvor in einem Genom nicht vorhandenen Gens
Wie funktioniert Mikroinjektion zur Generierung transgener Mäuse und was sind Vor- und Nachteile?
- Gewinnung von Eizellen und IVF
- Injektion in männlichen Vorkern der befruchteten Eizelle
- Integration der DNA ins Genom
- Implantation der Eizelle in Weibchen
- Geburt transgener Nachkommen
Vorteil: schneller, simpler Prozess
Nachteile:
▪ Zufälliger Einbau ins Genom
▪ Unbekannte Kopienzahl
▪ Verlust der Expression durch Silencing möglich
Wie wird eine transgene Maus durch homologe Rekombination generiert (ES-Zellen)?
- Gewinnung embryonaler Stammzellen
- Konstruktion eines ‚targeting vector‘
- Transfektion der ES-Zellen (Elektroporation)
- Integration ins Genom durch homologe Rekombination
- Selektion erfolgreich transfizierter ES-Zellen
- Qualitätskontrolle
- Einpflanzung der ES-Zelle in eine vorbereitete Leihmutter, Geburt der transgenen Mäuse, (ggf. Rückkreuzung der heterozygoten Mäuse gegen den Wildtyp, um homozygote Mäuse zu bekommen).
Gewinnung der inneren Zellmasse der Blastozyste
- Zellkultur: Feeder cells und Wachstumsfaktoren (LIF)
- Klonales Wachstum von ES-Zell-Kolonien (Hatching)
Typische Stammzell-Merkmale:
- pluripotent
- unbegrenzt teilungsfähig
- assymetrische Teilung
Was werden bei der homologen Rekombination für Selektionsmarker eingebaut?
Innerhalb der Homologie (zwischen zwei homologen DNA-Bereichen):
positiver Selektionsmarker (Neomycin → verleiht Antibiotikaresistenz). Durch Gabe eines Antibiotikum in die Zellkulturschale können die Stammzellen aussortiert werden, bei denen der Einbau nicht funktioniert hat.
Außerhalb der Homologie:
negativer Selektionsmarker gegen unspezifischen Einbau. Herpes simplex Thymidinkinase-Gen (HSV-tk) wandelt ein Substrat in eine toxische Substanz um, tk+ Zellen sterben (nicht-homologe Integration). D.h. war der Einbau unspezifisch (an falscher Stelle), sterben die Stammzellen nach Gabe des Substrats ab. Das HSV-tk-Gen wird nur bei unspezifischem Einbau exprimiert.
Was ist das Ziel der Transfektion von ES-Zellen?
Wie läuft diese ab?
Ziel: Einbau des Transgens ins Genom des Empfängers an definierter Stelle
- Transfektion in ESCs
- Homologe Bereiche in der DNA überlappen und es kommt zur Integration
- Kultivierung in Selektionsmedium mit Neomycin und tk-Substrat Gancyclovir
Wie werden die rekombinanten ES-Zellen selektiert?
positive (Neomycinresistenz-Gen) und negative (HSV-tk-Gen) Selektionsmarker
- Zellkulturschale wird mit Neomycin behandelt
(nicht-rekombinante Zellen sterben) - Zellen werden mit Ganciclovir (tk-Substrat) behandelt
(Zellen mit nicht-homologem Einbau sterben) - überlebende Zellen sind heterozygot für die Mutation
Wie geht man nach der erfolgreichen Rekombination vor?
- Injektion von rekombinierten Stammzellen in Maus-Blastozysten
- Transplantation in den Uterus einer Amme. Es entstehen Chimären (tragen genetische Information von transgenen ES-Zellen und WT ES-Zellen).
- Verpaarung der F1-Chimären
- Rekombinante Sequenz in den Keimzellen: Stabile Vererbung an Nachkomme
Zur Unterscheidung der Mäuse wird mit Rekombination auch der Phänotyp verändert. Beispiel: ES-Zellen verursachen braune Fellfärbung, normale Zellen verursachen schwarze Färbung. Chimäre haben beide Farben (Mosaik).
Welche Probleme gibt es mit Ganzkörper-Knockout-Mäusen? Was sind die Alternativen?
▪ Deletion des Gens kann zu (embryonaler) Letalität führen
-> Herstellung homozygoter Knock-Out Tiere nicht möglich
▪ Mögliche Kompensation des Knockouts z.B. durch Isoenzyme
▪ Gene haben unterschiedliche Funktionen in verschiedenen Geweben
-> es entstehen komplexe, schwierig zu interpretierende Phänotypen
Alternative:
▪ Untersuchung heterozygoter Knockouts, oder
▪ Knockout erfolgt erst im adulten Tier oder nur in bestimmten Organen
→ Konditionale Knockout-Modelle
Was ist das Cre/loxP-System?
System zur Erzeugung transgener Mäuse
2-Komponenten-System:
Kombination durch Verpaarung zweier transgener Mausstämme:
1. „Gefloxte“ Maus: Gen-Markierung (Beidseitige Markierung der Ziel-DNA-Sequenz, die deletiert werden soll, mit loxP-Sequenzen)
2. Cre-transgene Maus: DNA-Veränderung (Cre-Rekombinase: sorgt für Rekombination. In Abhängigkeit von der Anordnung zweier LoxP-Stellen kommt es zu Deletion, Inversion oder Translokation)
die genomische DNA wird an der Stelle der Rekombination verbunden und bleibt intakt (kein Strangbruch)
Wie wird die Cre-Expression reguliert?
Cre-Expression steht unter der Kontrolle eines zelltyp-spezifischen Gen-Promotors:
Auswahl des Promotors, unter dessen Kontrolle Cre steht, bestimmt,
▪ in welchen Zelltypen Cre exprimiert wird
▪ zu welchem Zeitpunkt (Wann wird das Gen normalerweise zum ersten Mal exprimiert?
Z.B. Albumin für Leber, MSK Creatinkinase für Muskel, Ap2 für Fettgewebe
In Zellen mit aktiver Cre-Rekombinase wird die Genfunktion zerstört und stattdessen ein Reportergen transkribiert. In Zellen, in denen keine Cre-Rekombinase aktiv ist, bleibt die Genfunktion erhalten.
Cre-ERT2: Tamoxifen-Induzierbares System
Induzierbarer Knock-out: Regulation der Cre-Aktivität
Tamoxifen ist ein Östrogenanalogon, das an den Östrogenrezepter (ER) bindet (ihn hemmt)
Cre-ERT2 bindet NUR Tamoxifen anstelle von Östrogen
Viele Kombinationsmöglichkeiten: z.B. Albumin-Cre-ERT2:
leberspezifisch und durch Tamoxifen induzierbar
Welche Mechanismen zur Steuerung der konditionalen Gen-Deletion gibt es (im Cre-System)?
Steuerung der Cre-Expression:
▪ IFN-sensitives System
▪ Tet-ON/Tet-OFF-System
Steuerung der Cre-Aktivität:
▪ Tamoxifen-CreERT2
