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BXY11 Molekularbiologie > VL10 Ribonomics > Flashcards

VL10 Ribonomics Flashcards

(72 cards)

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1
Q

RBP

A

RNA-binding protein – RNA-BIndeprotein

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Q

RBD

A

RNA-binding domain – RNA-BIndedomäne

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Q

IDR

A

Intrinsically disordered region

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4
Q

RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))

A

RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))

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5
Q

IP

A

IP – Immunoprecipitation/ Immunopräzipitation

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6
Q

CLIP

A

CLIP - Crosslinking and Immunoprecipitation

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7
Q

Vorkommen von RNA in Zelle

A
  • RNA ist in der Zelle nie “nackt“,
  • immer in einem Komplex mit Proteinen
  • von Proteinen begleitet - teils wie Staffelstab von Protein zu Protein weitergegeben
  • RNA liegt in Zelle gefaltet vor
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8
Q

Tissue Specificity score - niedrig?

A

wie spezial ist die Protein

niedrig - in fast allen Geweben / Zellklassen
hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse

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9
Q

Tissue Specificity score - hoch?

A

wie spezial ist die Protein

hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse

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10
Q

zelltyp- spezifische tRNA/rRNA-Binde-Proteine

viel oder wenig?

A

wenig

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11
Q

zelltyp- hochspezifische mRNA- Binde-proteine (mRBPs)

A

viele

aber auch viele zelltyp-spezifische

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12
Q

Bindungsarten von Proteinen an RNA

welche?

A

2:

Über RNA-binde Domänen in Proteinen

Über IDR = intrinsically disordered regions , ohne Bindedomäne

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13
Q

RRM

aufbau?

A

3 beta-Faltblaetter, 2 alpha-Helices - bindet an RNA

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14
Q

RRM

Beispiele?

A

zB YxiN - aus Bakterium (Bacillus)

zB Sxl - (sexlethal) aus Drosophila

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15
Q

RRM?

A

= RNA Recognition Motif

bekannteste, stark konservierte RNA Binde-Domäne in Proteinen

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16
Q

RNA-Binde-Domänen (RBDs)

Beispiele?

A

RRM - RNA Recognition Motif

Pumilio (Pum1)

Zink Finger

RGG Box

KH Domain, K homology Domain, DEAD-box helicase Domain…..

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17
Q

Pumilio?

A

RNA-Binde-Domaene (RBD)

aus viele alpha-helices (ca 10)

jede einzelne wirkt als „Finger“ und kann jeweils ein Nukleotid abtasten

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18
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

  • welche 3 Klassen?
A

Basische

Polare

Aromatische

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19
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Basische AS

Wie?
Welche AS?

A

Enden sind + geladen 🡪 passt auf RNA (RNA Rückgrat ist – geladen )

–

Arginin, Lysin, Histidin

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20
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Polare AS

Wie?
Welche AS?

A

ungeladen

OH-Gruppen am Ende die über Wasserstoffbruecken sich mit den Nukleotiden verknüpfen

–

Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin

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21
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Aromatische AS

Wie?
Welche AS?

A

Benzolring = delokalisiertes pi-Elektronensystem (können Licht absorbieren)

3D-Struktur von Bezolringe ist planar (flach aufm Boden)

→ in der Lage sich zwischen die „Sprossen“ der RNA „Leiter“ zu schieben

–

Tyrosin, Tryptophan

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22
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

welche Moeglichkeiten?

A

1: Sequenzspezifisch
Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen
mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen
2: Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA
IRE - iron response element- Hairpin
G quadruplex- Faltung

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23
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

sequenzspezifisch - wie?

A

Sequenzspezifisch:

Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen

mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen

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24
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA - wie?

A

Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA

zB:

  • IRE - iron response element- Hairpin
  • G quadruplex- Faltung
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25
Bindung von RB-Protein an RNA Komplex - warum? Vorteile davon?
RB-Proteine binden teils nicht unabhängig voneinander Kooperativität und multiple Bindungen verkompliziert alles Bindungen sind Kurzfristiger (vs. bei DNA) Hochdynamisch → in vitro schwer nachmachbar Vorteil: Höhere Affinität & Möglichkeit aendern Spezifität
26
RNA-Bindung mittels IDR?
Bindung ohne Domäne IDR = intrinsically disordered regions
27
RNA-Bindung mittels IDR Bsp
Beispiel: hnRNP A1 aus menschlichen Zellen
28
RNA-Bindung mittels IDR IDR-Region - wie besonders?
nicht gefaltet
29
RNA-Bindung mittels IDR Funktionsweise?
🡪 Proteine bilden Tropfen „blob“ 🡪 Proteine sind in den Kügelchen lokalisiert und diffundieren nicht durch Zelle 🡪 in den Tropfen-Region kann Proteine ohne Domänen an RNA binden Ohne IDR - keine Phasentrennung IDRs as organising principle for cellular localisation of functional RNPS RNA wirken auch bei Aufbau und Stabilisierung des Tropfen mit
30
Liquid-liquid phase seperation – Konzept
Phasentrennung: das Cytosol hat eine andere Dichte als der IDR-Komplex (wie Honigtropfen in Glas Wasser) In Tropfen anderes Milieu als in Cytosol- Medium (auch andere pH-Wert möglich)
31
Methoden und Techniken um individuelle RNPs zu untersuchen Immer Wechselspiel aus ___- und ___-Methoden
Immer Wechselspiel aus RNA- und Protein-Methoden
32
Untersuchung individuelle RNP welche Aufreinigungen
native denaturierte
33
Native Aufreinigung Vorteile / Nachteile?
Vorteile: Aufreinigung mild 🡪 Originalinteraktionen bleibt erhalten, Ganzer Komplex bleibt intakt Nachteile: Man kann nicht ganze chemie verwenden 🡪 Bindungen instabiler
34
Native Aufreinigung Crosslinking?
keine
35
Native Aufreinigung Buffer?
muss RNA-Protein Interaktion konservieren: milde Bedingungen
36
Denaturierte Aufreinigung Vor- und Nachteile?
Vorteile: - so sauber wie möglich - Bindungen stabil - weniger Kontamination, weniger Verunreinigung Nachteile: - keine Originalinteraktion
37
Denaturierte Aufreinigung Crosslinking
mit: - UV Licht (254nm) oder - Formaldehyd
38
Denaturierte Aufreinigung Buffer?
muss keine RNA-Protein Interaktion konservieren: - SDS /liDS - Harnstoff - viel / kein Salz - NP40/Triton-X/DTT
39
Techniken fuer Protein- Analyse Gel?
SDS-PAGE
40
Techniken fuer Protein- Analyse Detektion?
bekannte: Western blot mit Antikörper unbekannte: Mass Spectrometry
41
Techniken fuer Protein- Analyse Aufreinigung?
Immunopräzipitation | mit Antikörper
42
Techniken fuer RNA- Analyse Gel?
- PAGE (8M Urea) | - Agarose
43
Techniken fuer RNA- Analyse Detektion?
bekannt: Northern blot mit antisense Sonde quantitativ: q(RT)-PCR unbekannt: RNA-Seq
44
Techniken fuer RNA- Analyse Aufreinigung?
Antisense nucleic acid (Nukleinsäure) | zB oligo d(T)
45
UV-Crosslinking Ziel?
Ziel: RNA und Protein sollen fest, kovalent verbunden werden
46
UV-Crosslinking Funktioniert bei
nur bei RBPs, die direkt an RNA binden können Andere Proteine, die frei in der Zelle sind oder an RBP haften, werden nicht gebunden
47
UV-Crosslinking Ablauf
Licht regt Nukleo-Basen an elektronen kommen in Singulett Zustand, wollen jedoch wieder in nicht angeregten Zustand entweder: meistens fallen direkt zurueck in ungeregten Zustand → Wärmeabgabe oder gehen in Triplettzustand → dann Wärmeabgabe oder: können von Singulett oder Triplettzustand eine Crosslink mit AS bilden → Bildung feste kovalente Bindung
48
UV-Crosslinking Wellenlaenge von UV-Licht?
254 nm
49
UV-Crosslinking meistens welche Base / welche AS?
Uracil Cystein
50
PNK Assay? Untersucht? Antwort?
= Polynukleotid-Kinase-Test Untersuchung: ist Protein ein RNA-Binde-Protein Ja/Nein-Antwort; keine Aussage über welche RNA gebunden ist
51
PNK Assay
Protein rausziehen Labeling von RNA (radioaktiv) Analyse mit Proteingel → daraus Western blot Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie
52
PNK Assay 1 - Protein rausziehen?
Protein rausziehen: - UV-Crosslink, Kontrolle ohne Crosslink - Zell-Lyse - Immunopräzipitation gegen Protein von Interesse - Ziehen am Protein zieht RNA wegen Crosslink mit - RNAse Verdau (kleinere Fragmente machens Leben leichter)
53
PNK Assay 2 - Labeling von RNA
Labeling von RNA - radioaktives Markieren der RNA - mittels Poly-Nukleotid-Kinase → macht Nukl einsäuren radioaktiv
54
PNK Assay 3. Analyse mit Proteingel?
Analyse mit Proteingel → daraus Western blot: - Ohne Crosslink (Negativ-Kontrolle): nur Protein → klare Band - Mit Crosslink: Protein-Band + Schmier wegen RNA-gebundene-Proteine - Protein-RNA-Komplex ist größer als nur Protein 🡪 laufen nicht so schnell durch Gel 🡪 weiter oben in Gel angesammelt
55
PNK Assay 4. Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie
Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie: - Abbildung auf Autoradiographie zeigt radioaktives Signal der markierten RNA - An gleicher Stelle wo bei Western Blot „RNA-Schmiere“ erkennbar ist, sollte radioaktives Signal sein
56
CLIP-Seq? Untersucht?
= cross-linking immunoprecipitation-high-throughput sequencing Untersuchung: Welche RNAs ist/sind an meinem Protein gebunden
57
CLIP-Seq Arbeitsaufwand?
Arbeitsaufwand-Wiederholung Experiment 2+ replikate: Man muss Experiment mind. 2-3-mal machen jeweils mit ± UV-Crosslink (negativ-Kontrolle) --> 6 Libraries zum Sequenzieren schicken → 100-150 mio Reads Verschiedenste Konditionen Viele GB roher Daten
58
CLIP-Seq gleiche erste Schritte wie PNK Assay?
denaturierende Aufreinigung: UV-Crosslink Zelllyse RNAase Verdaut RNA (mit riesene RNA kann man nicht arbeiten) IP: Immunopräzipitation mit Antikörper 🡪 Zielprotein mit RNA rausziehen (bis hier wie bei PNK Assay)
59
CLIP-Seq erste Schritte die anders als bei PNK Assay sind
IP dann: 3’ Adapterligation: Ligation von radioaktive-RNA an 3‘ Ende der RNAs (die an Protein hängen) Gelelektrophorese Autoradiographie 🡪 radioaktive RNA-Schmiere Ausschnitt des Radioaktiven Teils aus Gelmembran, hier sind die RBPs enthalten Aufreinigen des Ausschnittes Proteinase Verdaut Protein 🡪 lässt nur noch ein kleines Stück Protein am Crosslink an der RNA bis hier fuer ganzen CLIP-Methoden sehr aehnlich, ab hier verschiedene Wege wie man weitermachen kann dann Schritte die besonders zu zB PAR-, HITS-, i- CLIP sind. dann PCR und Sequenzierung an Crosslink-Stelle macht Polymerase immer einen Fehler 🡪 in Analyse kann Crosslink-Stelle bestimmt werden, bis auf Nukleotid
60
CLIP-Seq PAR-/HITS-CLIP
besondere Schritte bei PAR-/HITS-CLIP PAR-CLIP: Photo-Activatable Ribonucleoside-enhanced CLIP HITS-CLIP: High-Throughput Sequencing of RNA isolated by CLIP 5‘ Adapterligation, in der Mitte ist unbekannte RNA (3’Ende frühere Adapterligation) 🡪 am 5’Ende und 3‘ End sind bekannte Sequenzen Reverse Transkription 🡪 Bildung cDNA iCLIP reverse Transkription cDNA bis Crosslink 2. Adapterligation
61
CRAC wirklich ???
CRAC: Crosslinking and Analysis of cDNAs - laeuft sehr aehnlich zu CLIP-Seq ab wirklich ???
62
RNA interactome capture Untersucht? Basiert auf? Nativ oder denaturierend?
Identifikation der Proteine die an mRNA gebunden sind Basiert auf: Fast alle mRNAs besitzen einen Poly-A Schwanz denaturierend
63
RNA interactome capture Ablauf?
Ablauf: - UV-Crosslink - Zelllyse - Oligo-dT (braune Kügelchen, ca 25 Ts) binden unspezifisch an Poly-A 🡪 mittels Oligo-dT- an RNA ziehen - RNase verdaut RNA - Massenspektrometrie
64
MS2-tag Untersucht?
Identifikation aller Proteine die mit einer spezifische RNA binden
65
MS2-Tag Ablauf?
Ziel-mRNA verlängern mit MS2-Tag (besteht aus Hairpins) MS2-Hüllprotein bindet sehr stark an Hairpins von MS2-tag MS2-Hüllprotein fusioniert mit GST (Glutathione S-transferase) GST steckt an beads (über Glutathione) → werden rausgezogen Aufreinigung Mit GFP/Biotin Markierung
66
MS2-Tag, MS2-Huellprotein Stammt aus?
Bacteriophage
67
MS2-Tag - Nachteil
Nachteile: MS2-tag ist sehr lang (ca 14) 🡪 sehr viele Hairpins benötigt, damit es effizient wird Schwierig: Einschleusen von modifizierter RNA in Zelle
68
Tiling
Problem bei ‘klassischen Pull-Down (antisense-oligo-Sonde): können multiple RNA binden Lösung - Tiling: viele kleinere antisense oligos, die individuell auf Ziel perfekt passen, komplett bedecken Fehler verteilt sich Wurde ChIRP genannt (Chromatin Isolation by RNA purification)
69
PTex (Phenol Tolul extraction) Untersucht?
Identifiziert alle RNP von Zelle
70
PTex (Phenol Tolul extraction) nativ oder denaturierend
denaturierend
71
PTex (Phenol Tolul extraction) basiert auf
Phasentrennung mit Phenol aufgrund Molekültyp
72
PTex (Phenol Tolul extraction) Ablauf
Ablauf: UV-Crosslinking, Zelllyse Phenol-toluol Phasentrennung: lipide usw weg acidic Phenol → Phasentrennung - oben: wässrige Phase - RNA - Mitte: Übergangsphase - crosslinked Protein+RNA - unten: organische Phase - Proteine Weitererarbeitung mit Übergangsphase

BXY11 Molekularbiologie (10 decks)

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