von Ballmoos Flashcards

Question

Proteinsolubilisierung

Answer 1

* Um ein Membranprotein zu solubilisieren (in Lösung zu halten), muss die Konzentration oberhalb der CMC liegen. * Wichtig ist auch das Verhältnis zwischen Protein und Detergenz (es muss genügend Detergenzmoleküle pro Protein haben). * Um ein Protein aus der nativen Membran zu holen, braucht es noch viel mehr Detergenz, um auch alle Lipide zu solubilisieren (Lipid/Detergenz Verhältnis).

Answer 2

* Kurzkettige Detergenzien solubilisieren die Membran besser, sind allerdings auch eher denaturierend --\> hohe CMC * Oft werden verschiedene Detergenzien eingesetzt, ein kurzkettiges zum Solubilisieren und ein langkettiges zum Aufbewahren * Detergenzien müssen immer oberhalb der CMC gebraucht werden, um ein Protein in Lösung zu halten * Jedes Protein hat sein bevorzugtes Detergenz, es ist unmöglich, das ideale Detergenz im Voraus zu bestimmen

Answer 3

* Verdünnen unter CMC * Dialyse, wenn die Micelle \< 30 kDa ist * Protein an Säule binden, Detergenz wegwaschen * Binden von Detergenz an adsorbierende Materialien (z.B. Bio Beads)

Answer 4

* Bestimmen der Totalproteinkonzentration (\>99 % ist nicht das gesuchte Protein) * Fällung/Dichtezentrifugation als erster Schritt * Weitere Anreicherung des gesuchten Proteins mithilfe von chromatographischen Trennmethoden * Reine Darstellung mittels Gelfiltration * Enzymaktivität

Answer 5

Aminosäureanalyse Kolorimetrisch (Färben) Spektroskopisch Radioaktive Markierung

Answer 6

* Biuret-Assay * Lowry-Assay (1951) * Bicinchoninsäure (BCA)-Assay / Smith-Assay (1985) * Bradford-Assay (1976)

Answer 7

* UV-Detektion * Fluoreszenz

Answer 8

Basis: **Biuret-Reaktion** * Umsetzung mit Bicinchoninsäure (BCA) * Bildung Cu+-BCA-Komplex * In alkalischer Lösung reduzieren Proteine Cu2+ zu Cu+ * proportional zur Proteinmenge (Tyr, Trp, Cys beschleunigen) * Detektion photometrisch: 562 nm

Answer 9

A = log (I₀/I) = ε \* c \* d A: Absorption I₀ / I: Intensität eintretendes Licht / Intensität austretendes Licht d: Schichtdicke [mm] ε: molarer Extinktionskoeffizient [L / mol · mm] c: Konzentration [mol / L] bei 280 nm (A280): Trp, Tyr, (Phe, bei A254)

Answer 10

Kein allgemein gültiges Reinigungsschema für Proteine (im Gegensatz zu DNA / RNA) verschiedene physikalisch/chemische Parameter berücksichtigen --\> oft grosse Konzentrationsunterschiede der Komponenten Entfernung von Matrixkomponenten (Zellkomponenten) --\> Zentrifugation, Ultrafiltration, Fällung Hauptreinigung / Fraktionierung - Chromatographie - Elektrophorese - andere Methoden - **schnell**: möglichst wenige Reinigungsschritte - **effizient**: hohe Ausbeute - **selektiv**: gesuchte Komponente möglichst rein - **schonend**: im nativen Zustand, biologisch aktiv - -\> möglichst keine Aufarbeitungsartefakte

Answer 11

Substanzgemisch

Answer 12

Laufmittel, oft Lösungsmittelgemisch

Answer 13

Füllmaterial der Trennsäule

Answer 14

Physikalische / chemische Stabilität * Biopolymere: Cellulose, Dextran, Agarose * Synthetische Polymere: Polyacrylamid, Polymethacrylate, Polystyrole * Anorganische Polymere: Kieselsäure, Hydroxyapaptit, poröse Glaskügelchen * Funktionelle Gruppe: chromatographischer Trennmodus

Answer 15

Trennung gelöstes Substanzgemisch im Gas- oder Flüssigkeitsstrom über stationärer Phase Analyt interagiert mit stationäre Phase

Answer 16

Trennqualität der chromatographischen Säule je höher die Bodenzahl n desto besser die Trennung bei gegebener Säulenlange L

Answer 17

h = L / n Bei gegebener Säulenlänge L sollte die Bodenhöhe h minimal sein, um eine maximale Trennung (hohes n) zu erhalten. In der Praxis bessere Trennung durch: Änderung der mobilen Phase, Änderung der stationären Phase, Verwendung längere Säule

Answer 18

Die aufzutrennenden Moleküle interagieren mit der stationären Phase und diffundieren in der mobilen Phase. Dies kann zu Peakverbreiterung führen und damit zu einer Reduktion der Bodenzahl n und einer schlechteren Auflösung führen.

Answer 19

Für kleinere Moleküle sollte die Flussrate maximal gewählt werden, damit die Diffusion minimal ist, eine Wechselwirkung mit der stationären Phase gibt es hingegen nicht. Für Proteine (grosse Moleküle) ist die Diffusion in der mobilen Phase vernachlässigbar, aber die Wechselwirkung mit der stationären Phase nimmt mit zunehmender Flussrate zu. --\> Es gilt also eine ideale Flussrate zu finden

Answer 20

* Biospezifität * Metallchelat-Affinitätschromatographie **Prinzip**: spezifische, reversible Adsorption an Matrix Einige Säulen mit bestimmten Liganden sind kommerziell erhältlich. Andere müssen selbst an den Säulensupport gekoppelt werden. - K_D: 10^-5 - 10^-7: biospezifische Wechselwirkung - K_D: \> 10^-5: Bindung zu schwach - K_D: \< 10^-8: Bindung zu stark: Desorption nur denaturierend

Answer 21

• Ladung **pI**: Isoelektrischer Punkt (IEP): pH-Wert Nettoladung Protein null Coulomb-Gesetz Kleine Partikel (~10 μm, mehr Oberfläche pro cm Säule) geben eine bessere Auflösung, verlangen aber höhere Drücke --\> spezielle Apparatur Kann zu jedem Zeitpunkt der Reinigung angewandt werden, entsprechend werden aber verschiedene Säulen mit verschiedenen Partikelgrössen verwendet Man kann IEX auch so durchführen, dass das gewünschte Protein nicht bindet, dafür aber viele andere. Keine Aufkonzentrierung!

Answer 22

• Hydrophobizität

Answer 23

High Pressure/Performance Liquid Chromatography, HPLC **Umkehrphase** (Reverse(d)-Phase, RP), RP-HPLC * Trenn-Prinzip: vor allem Hydrophobe Wechselwirkung * **Ionenpaarreagens**(z): z.B. Trifluoressigsäure(TFA) * Zur Auftrennung von polaren/ionischen Molekülen, oft grösser als 500 Da. Mild und rasch, geeignet für thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen. **Stationäre Phase: modifiziertes Kieselgel** Elutrope Reihe

Answer 24

Glykoproteine

Answer 25

Proteine der Blutgerinnung

Answer 26

Immunoblobuline G

Answer 27

Ca²⁺-bindende Proteine

Answer 28

Dehydrogenasen, Kinasen

Answer 29

Viele Enzmye, komplex

Answer 30

GST-fusion protein

Answer 31

Biotin/Streptag

Answer 32

MBP-fusion protein

Answer 33

**Adsorption** (Selektiv aus komplexem Gemisch) **Waschen** (Entfernen unspezifisch gebundene Komponenten) **Desorption** (Kompetitive Verdrängung gebundene Komponente(n)) **Regeneration** (Reinigung / Regeneration Matrix)

Answer 34

Ni²⁺-NTA-Agarose Elution mit Histidin, Imidazol oder EDTA 6-10 Histidine werden auf DNA Ebene am N- oder C-terminus ans Protein angefügt (selten auch in Loop- Regionen) und das Protein danach exprimiert. --\> His-Tag Der Extrakt nach dem Zellaufschluss (nach Zentrifugation) wird dann direkt auf die Säule gegeben, gewaschen und eluiert. Statt NTA könne auch andere Säuren verwendet werden. Statt Ni²⁺ wird auch Co²⁺ verwendet.

Answer 35

**Vorteile:** * Spezifische Interaktion, unter Umständen «One-step purification» möglich * Einfacher Ablauf: Laden, waschen, eluieren! * Bei rekombinanten Proteinen kann ein His-Tag hinzugefügt werden **Nachteile:** * Nicht für alle Proteine möglich * Oft ist der Bindungspartner teuer oder kompliziert herzustellen --\> keine kommerzielle Lösung * Herstellen einer eigenen Affinitätsmatrix kann aufwändig sein * Entfernen des Eluenten kann aufwändig sein

Answer 36

E_coul = (q⁺ \* q^-) / (ε₀ \* ε_r \* r) q⁺, q^-; Ladungen r: Abstand der Ladungen ε₀: elektrische Feldkonstante ε_r: Medium abhängige Konstante

Answer 37

**Adsorption:** Bindung der geladenen Teilchen an Matrix **Elution** (Verdrängung): • Steigender Salzgehalt: Erhöhung der Ionenstärke • Elution mittels pH-Gradient: Verschiebung pH-Wert **Regeneration:** Reinigung / Regeneration Matrix

Answer 38

**Vorteile** * Mit allen Proteinen möglich, auch Membranprotein, kein Affinitäts-Tag nötig. * Bei jeder Reinigungsstufe möglich, kompatibel mit Detergenzien * (Semi)-spezifische Bindung mittels Ladungen (vor allem schwache Tauscher) * Ausgangsmaterial kann verdünnt sein, es wird an der Säule aufkonzentriert. * Relativ billig **Nachteile** * Unter Umständen relativ geringe Trennung * Grosse Säulen notwendig, wenn viel Ausgangsmaterial vorhanden ist * Austesten für optimale Auflösung kann langwierig sein

Answer 39

* Wasser * Salz * Anderen Proteinen, DNA * Ev. Detergenz * Andere kleine Moleküle

Answer 40

Size Exclusion Chromatography, SEC • Grösse, Form, hydrodynamisches Volumen * *wässrig**: Gelfiltration * *nicht-wässrig**: Gelpermeation **Moleküle \>\> Poren**: Elution Ausschlussvolumen V₀ **Moleküle ≅ Poren**: Elutionsvolumen V_M (Summe internes Porenvolumen + Partikelzwischenraum) **Moleküle \<\< Poren**: längste Aufenthaltsdauer in Poren, in den Poren frei beweglich Meist am Schluss einer Reinigung verwendet, wenn das Protein schon relativ rein ist.

Answer 41

* Trenngel (Porengrösse) * Lösungsmittel / Puffer * pH-Wert * Probenvolumen * Säulendimension

Answer 42

**Elutionskraft** = Abnahme Polarität --\> Wasser --\> Methanol --\> Acetonitril --\> n-Propanol --\> Tetrahydrofuran \<-- Zunahme Polarität

Answer 43

* Entgasen der Lösungsmittel ist wichtig, damit keine Luft in die Säule gelangt. Gerade bei hohen Drücken würde jegliches Gas freigesetzt. * Pumpe sollte nicht pulsieren --\> gleichmässiger Fluss, stabile Detektion * Geringes Totvolumen des ganzen Systems --\> schneller Gradientenaufbau * Die Säule ist temperaturkontrolliert, weil das Bindeverhalten der Moleküle temperaturabhängig ist und dadurch die Trennleistung beeinflussen kann. * Druckstabilität (bis 400 bar) * Verschiedene Detektoren möglich: Absorption (UV, VIS, IR), Fluoreszenz, Brechungsindex, Lichtstreuung, Elektrochemie, Massenspektrometrie

Answer 44

Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld **Beschleunigende Kraft F_e** und **Bremsende Kraft, Reibungskraft F_fr** im Gleichgewicht: keine Beschleunigung, konstante Geschwindigkeit! **Wanderungsgeschwindigkeit / Elektrophoretische Mobilität u**

Answer 45

F_e = q \* E mit q = z \* e E: elektrische Feldstärke q: Ladung Teilchen e: Elementarladung z: Anzahl Ladungen

Answer 46

F_fr = f \* v f: Reibungskoeffizient v: Wanderungsgeschwindigkeit geladenes Teilchen

Answer 47

v = q \* E / f = u \* E mit u = q / f v: Wanderungsgeschwindigkeit geladenes Teilchen q: Ladung Teilchenf Reibungskoeffizient E: elektrische Feldstärke u: elektrophoretische Mobilität

Answer 48

* Für Proteine wird meist eine Mischung von 29:1 Acrylamid/Bis verwendet (3.3 % crosslinking). * Für Peptide oder DNA Sequenzierung wird mit 19:1 (5% Crosslinking) gemacht

Answer 49

Puffer mit pH \> 7. Dadurch sind die meisten Protein negativgeladen und wandern zur Anode.

Answer 50

• **Sammelgel** (weitporig): Isotachophorese: pH 6.8 --\> inhomogener Puffer Leit-Ion: Chlorid Folge-Ion: Glycin (IEP: 5.97) -Gleiche Mobilität aller Moleküle. Bildung von Stapeln von Proteinen: --\> **Stacking-Effekt** • **Trenngel** (engporig): Zonenelektrophorese: pH 8.8 --\> homogener Puffer - unterschiedliche Mobilitäten: Trennung nach Grösse

Answer 51

Diskontinuierliche Elektrophorese * SDS (Sodium Dodecyl / Lauryl Sulfate): anionisches Detergens * denaturiert und linerarisiert Protein (erhitzen auf 95 °C) * bildet lineare Micellen konstanter negativer Ladung * bindet ca. 1.4 g SDS / g Protein * CMC_SDS: 8 mM * Genauigkeit: ca. 5 –10 % * Je länger das Protein, desto mehr SDS kann gebunden werden, dadurch ist die relative Ladung (m/z) oder Geschwindigkeit im elektrischen Feld etwa gleich und aufgetrennt wird nach Grösse, weil lange Stücke im Gel mehr zurückgehalten werden als kurze. * SDS bindet vor allem hydrophobe Stellen --\> Membranproteine haben daher mehr relatives SDS als lösliche Proteine --\> wandern «zu schnell», bzw. zeigen ein zu kleines Molekulargewicht.

Answer 52

für Membranproteine Statt SDS wird Coomassie verwendet, welches sich auch ans Protein anlagert, es dabei aber nicht denaturiert Auftrennung von Komplexen in Mitochondrialen Membranen --\> Komplex I

Answer 53

D: Diffusionskoeffizient E: Feldstärke d(pH)/dx: pH-Gradient ΔpI: Auflösungsvermögen du/d(pH): Mobilitätssteigung Protein am pI

Answer 54

Trennung nach Ladung und Grösse Es können ganze Lysate aufgetrennt werden. Interessant auch für Viren und Bakterien und Zellen, welche verschieden behandelt wurden. Durch einfaches Vergleichen der Proteinpunkte (Spots) können Unterschiede in der Proteinexpression festgestellt werden. Das volle Potential der 2D Elektrophorese wird dann zusammen mit massen-spektrometischer Analyse genutzt. * *1. Dimension: Nach Ladung** - isoelektrischeFokussierung - immobilisierter pH-Gradient (pH-Gradient wählbar) - Trennung auf IPG-Streifen * *2. Dimension: Nach Grösse** - SDS-PAGE

Answer 55

* DNA: Southern-Blotting (1975: E. Southern) * RNA: Northern-Blotting * Proteine: Western-Blotting (Immunodetektion, blot staining, Edman sequencing)

Answer 56

**Blotting-Membranen**: • Nitrocellulose (NC) • Polyvinylidendifluorid (PVDF) • Polypropylen (PP) • Silikonisierte Glasfasern (SGF)

Answer 57

Immunodetektion

Answer 58

Klassisch: Aminosäuren haben funktionelle Gruppen, die häufig die Aktivität des Proteins beeinflussen. Durch Modifikation der funktionellen Gruppe wird die Aktivität geblockt und das aktive Zentrum kann identifiziert werden.

Answer 59

* NMR Analyse, Einbau von 2H, 13C, 15N, durch Zugabe ins Medium * Einführung von Reportergruppen zur späteren Analyse: Fluoreszenzmarker, Biotin, Spinlabel, orthogonale Gruppe (Click Chemistry), etc. * Vernetzung von Proteinen, photocrosslinking * Affinitätslabeling

Answer 60

Proteine tragen funktionelle Gruppen (selektiv) modifizierbar: - basisch: **Lys**, Arg, His - sauer: Asp, Glu - aromatisch: Tyr, Trp, Phe - S-haltig: **Cys**, Cys–Cys, Met \>90% aller Modifikationen werden an Lysinen und Cysteinen durchgeführt!!

Answer 61

Aminogruppe Acylierung, Amidierung * Reaktion benötigt ein primäres Amin (deprotoniert), also einen pH \> pKa Lysine (~10.5). Ist nicht möglich, da denaturierend --\> deshalb pH so hoch als möglich. Problem, die Reagenzien sind instabil bei hohem pH. * --\>Spezialfall: N-terminus (pKa ~8). Diese Aminogruppe kann spezifisch bei pH 7.5 gelabelt werden.

Answer 62

positive Ladung geht verloren

Answer 63

positive Ladung geht nicht verloren

Answer 64

um Kanal zu identifizieren * Reaktion benötigt ein reduziertes Cysteinzur Reaktion mit Alkylhalidenoder Maleimiden. Zur Reduktion können DTT oder Mercaptoethanol eingesetzt werden, die aber vor der Reaktion wieder entfernt werden müssen. Besser ist das TCEP! * Das Thiolat-Anion (pK~8.3) ist reaktiver als die Thiolform, allerdings sind die Reagenzien bei hohem pH instabil. Kompromiss liegt bei ungefähr pH 7-7.5. * Labeling von Cystein ist selektiv, bei gutem pH durchführbar und zeigt wenig Seitenreaktionen. Oftmals wurde das Cystein via ortsgerichteter Mutagenese eingeführt.

Answer 65

Koppeln zwischen Lysinen: Dissulfidbrücke, Spaltbar mit DTT, Mercaptoethanol, TCEP Koppeln zwischen Cystein und Lysinen: Dissulfidbrücke, Spaltbar mit DTT, Mercaptoethanol, TCEP

Answer 66

Click chemistry Refers to any chemical reaction that can occur in the presence of other rich chemical functionalities found in biological systems without interacting or interfering with native biochemical processes. The bioorthogonally-activated components react specifically and spontaneously only with eacht other forming the desired conjugate.

Answer 67

Es gibt Hunderte von Fluoreszenzfarbstoffen mit den verschiedensten Eigenschaften: • Verschiedene Farben • Reaktivität auf pH, Ionenstärke • Reaktivität auf Umgebung (polar, apolar) **Detektion**: Westernblot, Mikroskopie, Spektroskopie

Answer 68

Spaltung mit Cyanogenbromid (CNBr) nach Met

Answer 69

* *vollständige Proteolyse**: 4 – 16 h, 37°C - Peptidmuster (finger prints, peptide maps) * *limitierte Proteolyse**: kürzere Spaltzeiten (min → h) - in der Regel native Proteine - Generierung Domänen (funktionell aktiv) - Generierung Cys-haltiger Fragmente: Disulfidbrückenmuster * *Enzym / Substrat-Verhältnis:** - Spaltung in Lösung: 1:20 bis 1:100 - Spaltung im Gel / auf Membran: 1:1 bis 1:10 (Autoproteolyse möglich) - unspezifische Spaltungen möglich

Answer 70

- Gehalts- / Mengenbestimmung von Proteinen / Peptiden ⇒ Saure Hydrolyse erforderlich ⇒ Analyse ist probenunabhängig (fest, flüssig, gasförmig) - Quantitative Bestimmung freier Aminosäuren in Lösung

Answer 71

- Jedes Protein hat charakteristisches AS-Muster (Fingerabdruck) - Identifizierung von Proteinen in Proteindatenbank mit AS-Muster

Answer 72

AS-Muster freier AS: Erkennung von Krankheiten

Answer 73

Bedingungen: 6 M HCl, 110°C, 24h, N₂ (Vakuum) **Hydrolyse**: Flüssig oder gasförmig - Ser, Thr, Met: 10 – 20% Verlust - Cys, Trp: 50 – 100% zerstört - Cys: Alkylierung zur Quantifizierung, z.B. Iodacetamid - Asn, Gln, CAM-Cys: Deaminierung zu Asp, Glu, CM-Cys - Ile – Val, Val – Val, Ile – Ile: Bindungen hydrophobe AS ⇒ in 24 h unvollständig hydrolysiert

Answer 74

* Ninhydrin (klassisch) * Absorption / Fluoreszenz (modern) * Aminogruppe wird gelabelt

Answer 75

Identifikation N-terminale AS in Proteinen / Peptiden * Markierung N-terminale AS mit Sangers Reagens DNFB (Dinitrofluorobenzol) * Anschliessend saure Hydrolyse des Proteins * Identifikationder N-terminalen AS UND der Aminosäuren-zusammensetzung. * Immer nur die N-terminale Aminosäure kann detektiert werden. --\> Vorgängige partielle Spaltung. * Kompliziert, braucht extrem viel Protein, muss mehrfach repetiert werden --\> Nobelpreis 1958 für die Sequenzierung von Insulin (~100 g).

Answer 76

Kupplung Abtrennen von überschüssigem Reagens und Nebenprodukten durch Extraktion in org. Lösungsmittel. Protein bleibt gefällt.

Answer 77

Spaltung Extraktion der ATZ-Aminosäure durch org. Lösungsmittel. Restpeptid wird getrocknet und vorbereite für nächste Spaltung. Kein O₂ erlaubt, N₂ Atmosphäre

Answer 78

Konversion z.B. ATZ-Aminosäure + Wasser zu PCT-Aminosäure + H⁺ zu PTH-Aminosäure + Wasser

Answer 79

- Probe muss einheitlichen N-terminus haben --\> Gelbande --\> Blot - N-terminus darf nicht blockiert sein - Ultra reine Lösungsmittel nötig - Gewisse AS werden während der Konversion zerstört - Schlechte Zyklen Ausbeute macht Interpretation schwierig. Nur im ersten Run gibt es nur eine Aminosäure. - Max. 30-60 Aminosäuren möglich

Answer 80

Genaue MassevonBiopolymeren: \> ±0.01% Reinheitsprüfung von Biopolymeren Sequenz von Peptiden, Oligonukleotiden, Oligosacchariden Analyse von posttranslationalen Modifikationen (PTMs) - **Disulfidbrücken**: in den meisten Proteinen vorhanden - **Glykosylierungen**: viele Proteine sind glykosyliert - **Phosphorylierungen**: Signalübertragung, Aktivierung - **N-terminale Modifikationen**: ca. 10% aller Proteine

Answer 81

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation * *UV-Laser:** - Stickstoff-Laser (337 nm) - Nd-YAG-Laser (355, 266 nm) **IR-Laser**: - Er-YAG-Laser (2,94μm) YAG: Yttrium-Aluminium-Granat-Kristalle

Answer 82

Mehrere Teilprozesse * Desorption der Analytmoleküle aus einer Matrix mittels Laserpuls * intensiver, kurzwelliger Laserpuls (normalerweise nur einige ns) * Einkopplung der Energie, oft über ein π-Elektronensystem * Explosionsartiger Phasenübergang * Matrix- und Analytmoleküle in die Gasphase * Übertragung der Ladung (H⁺/Na⁺/K⁺) von der Matrix auf den Analyten * ohne Zerstörung thermisch labiler Moleküle * z.B. Proteine, Peptide, Oligonukleotide, DNA, RNA, Polysaccharide Matrix im grossen molaren Überschuss (1'000–10‘000 fach)

Answer 83

Flugzeitanalysator: TOF-Analysator (Time of Flight) ⇒ **MALDI-TOF** **Beschleunigungsstrecke**: Ionen im elektrischen Feld auf einige keV beschleunigt **Feldfreie Driftstrecke (Flugrohr):** 1–4 m Ionen gleicher kinetischer Energie nach m/z Verhältnis getrennt **Flugzeit**: einige μs – einige 100 μs

Answer 84

**Lineares Flugrohr**: Ionen haben Unschärfe bezüglich Energie, Ort, Zeit --\> Delayed extraction **Reflektor-Flugrohr**: Reflektor ("Ionenspiegel"), m₁ = m₂, E₁ \< E₂

Answer 85

* *Durchschnittsmasse (averag emass):** - Berücksichtigung der prozentualen Verteilung aller Isotope * *monoisotopische Masse (monoisotopic mass):** - exakte Masse des jeweils häufigsten Isotops * *nominelle Masse (nominal mass):** - ganzzahlige Masse des jeweils häufigsten Isotops

Answer 86

* *Elektrospray**: - Dispersion einer Flüssigkeit in viele kleine, geladene Tröpfchen mit Hilfe eines elektrischen Feldes * *Desolvatisierung**: - Transfer von Ionen aus der Lösung in die Gasphase

Answer 87

1) Bildung kleiner geladener Teilchen eines Elektrolyten 2) Lösungsmittelverlust durch Verdampfen ⇒ Ladungsdichte an der Tröpfchenoberfläche nimmt zu 3) Mehrfacher spontaner Zerfall der Tröpfchen in Mikrotröpfchen ⇒ Coulomb-Explosion 4) Desolvatisierung der Analytmoleküle beim Transfer ins MS ⇒ Entzug thermischer Energie beim Verdampfen

Answer 88

Stabilitätsgrenze der Tröpfchen Gleichgewicht von: **Coulomb-Abstossung** gleicher Ladungen im Tröpfchen **Oberflächenspannung** des Lösungsmittels im Tröpfchen

Answer 89

Kombination von Wechselspannung und Gleichspannung an den Stäben - Gleichspannung: U - Wechselspannung: V \* cos 2π \* f \* t - Frequenz: f - Radius: r U und V werden so gewählt, dass nur ein einziges m/z durch den Massenfilter fliegt, alle anderen werden von den Stäben so abgelenkt, dass sie kollidieren und abgebremst werden. --\> Es muss ein Scan durchgeführt werden.

Answer 90

dienen als Energiespeicher The chemical equilibrium between two compartments is the preferred state (lowest energy). After work is performed, the system is in a non-equilibrium state. Hereby, the membrane prevents re-equilibration and the energy (of the work) is stored in form of a chemical and/or electrical gradient. When the system returns to the equilibrium, the stored energy can be used to perform (a different type of) work.

Answer 91

* Ionen Pumpen (Redox or ATP getrieben, H⁺, Na⁺, Ca²⁺, K⁺) --\> primäre Transporter * Kommunikationen zwischen Kompartimenten (Rezeptoren, Nährstoffaufnahme, sekundäre Transporter) * Transport zwischen Kompartimenten (z.B. mitochondriale Carrier Proteine, e.g. ADP/ATP Exchanger) * Membran-Verankerungsproteine

Answer 92

Um Transport Prozesse zu untersuchen, braucht es ein abgeschlossenes Kompartiment, welches durch eine Membran abgetrennt ist. Milde Tour: ROS-Membranvesikel Grobe Tour: ISO-Membranvesikel

Answer 93

**Inside out (Inverted vesicles)** * Zellen werden in Aufschlusspuffer gewaschen und mittels French Press aufgeschlossen (Auch Ultraschall) * Membranen werden aufgebrochen und schliessen sich wieder, dabei ändert sich die Orientierung. * Äussere Membran kann entfernt werden (Dichtegradient) * Zellinneres wurde ausgetauscht durch Aufschlusspuffer

Answer 94

Liposomen formen sich spontan, wenn eine getrocknete Lipidschicht (gelöst in organischen Lösungsmitteln) mit Puffer hydratisiert wird - -\> Minuten bis Stunden, eventuell erwärmen - -\> Wird das einigermassen mild gemacht, entstehen sogenannte Multilamellare Vesikel (MLV) --\> Drug Transport

Answer 95

• Ultraschallbehandlung: Dadurch werden aus MLV SUV, ca. 30 –80 nm. • Wiederholtes Gefrieren in flüssigen Stickstoff und Auftauen bei 25°C --\> es entstehen LUV, \>400 nm • Die LUV können dann durch Pressen durch eine Membran (Extrusion) auf die gewünschte Grösse gebracht werden, z.B. 100, 200 nm.

Answer 96

**JEDES PROTEIN BRAUCHT EIGENES PROTOKOLL !!** **Methode 1:** Solubilisierte Lipide werden mit dem solubilisiertenProtein gemischt. Beim Entfernen des Detergenz entstehen Liposomen, die (hoffentlich) Protein enthalten. • **Verdünnen** --\> Die Suspension wird rasch soweit verdünnt, bis die Konzentration des Detergenz deutlich unter der CMC liegt. (~min. 20-fache Verdünnung). --\> Detergenzien mit hoher CMC: Octylglucoside, CHAPS, Na-Cholate • **Dialyse** --\> Die Protein/Lipid Suspension wird in einen Dialyse Schlauch gegeben, und dieser wird gegen einen Puffer ohne Detergenz dialysiert. Porenweite der Membrane \>\> als Micellengrösse. --\> Detergenzien mit hoher CMC: Octylglucoside, CHAPS, Na-cholate • **Adsorption** der Detergenzmolekülean feste Matrix (Bio-Beads), dauert Stunden, aber funktioniert auch mit Detergenzien mit tiefer CMC: DDM, Triton X-100, aber auch Octylglucoside, CHAPS, cholate **Methode 2**: Vorgefertigte Liposomen werden nur «destabilisiert» mit Detergenz, welches anschliessend entfernt wird. Gelfiltration, Bio-Beads, Dialyse. **Methode 3**: Ohne Detergenz, klappt erstaunlich oft. Vorgefertigte Liposomen werden mit Protein in Detergenz gemischt --\> Beim Mischen muss die Konzentration des Detergenz unter die CMC fallen. Danach wird die Suspension in flüssigem Stickstoff gefroren und langsam aufgetaut (1 –3 x) und kurz sonifiziert. Beim Auftauen werden die Liposomen destabilisiert und erlauben die Aufnahme des Membranproteins.

Answer 97

ATP Synthasein Liposomen ATP Hydrolyse wird gemessen

Answer 98

**Vorteile**: • Definiertes System • Keine anderen Enzyme • Lipidmischung kann gewählt werden • Nur ein Enzym pro Liposom möglich • Mutanten mit geringer Aktivität können untersucht werden (kein Background) **Nachteile**: • Tiefes Protein/Lipid Verhältnis • Mögliche falsche Orientierung des Proteins im Liposom. • Co-Rekonstitution von mehreren Proteinen ist schwierig, da individuelle Protokolle nötig • Oft verliert das Protein seine Aktivität während des Handlings (Detergenz, etc)

Answer 99

**Natürlicher Mechanismus**: Die Aufnahme muss energetisiert/angetrieben werden (deshalb sekundärer Transport) **Influx**: Kann passieren, wenn die Zelle in ein laktosereichesMedium gelangt --\> dauert aber nicht lange **Efflux**: Kann passieren, wenn die mit Lactoseangereicherte Zelle in ein Medium ohne Lactose gelangt.

Answer 100

selektiver K⁺-Ionophor Makrolid-Antibiotika wird von Streptomyceten (Bakterien) produziert Es lagert sich in den hydrophoben Teil der Membran an und katalysiert dort den Austausch von K⁺-Ionen.

Answer 101

durch K⁺/Valinomycin Diffusionspotential

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