הנדסה גנטית Flashcards
(42 cards)
מהי טכנולוגיית סדנא רקומביננטי
עוסקת בשינויים בחומר התורשתי ובהבנת הפעילות של גן מסוים ע”י בידוד גן אחד מתוך אלפי גנים.
בבני אדם ישנם עשרות אלפי גנים.
מהם 3 הדברים שצריך ליצירת דנא רקומביננטי
לצורך יצירת דנ”א רקומביננטי יש צורך ב:
1. חיידקים
2. פלסמידים
3. מקטע דנ”א שמכיל את הגן אותו רוצים לבטא
ביטוי הגן הרצוי נעשה באמצעות וקטור של דנ”א שנקרא פלסמיד המשמש כנשא של אותו מקטע דנ”א.
תארי את אופן הפקת הד-נ-א הרקומביננטי בכותרות
חותכים את הפלסמיד )מולקולת דנ”א מעגלי( ומכניסים לתוכו את מקטע הדנ”א המבוקש. מתקבלת
מולקולת דנ”א רקומביננטי.
את הפלסמיד מחדירים לחיידק –
o בנוסףלפלסמיד לחיידק ישכרומוזום גנומי–כרומוזוםבודדמעגליהמכילאתהדנ”אשל
החיידק.
o לפלסמידהרקומביננטיישיכולתהתרבותעצמית–יודעלייצרמספרהעתקיםשלאותו
מקטע דנ”א. )התרבות הפלסמיד לא תלויה בחיידק(. o החיידקמתחלקכל20דקותומייצרהרבהחיידקיםופלסמידיםעםהגןהמבוקש.
בנוסף ליכולת ההתרבות העצמית שלהם, הפלסמידים מכילים גן עמיד לאנטיביוטיקה. o לוקחיםאתכלהחיידקיםשמכיליםאתהדנ”אהרקומביננטי,וזורעיםאותםעלמצעאגר
שמכיל אנטיביוטיקה שיוצרת סלקציה בין חיידקים שמכילים את הפלסמידים הרקומביננטיים לבין אלה שלא. כלומר כל מושבה שנקבל על המצע מכילה את הפלסמידים.
מהו הפלסמיד מה יתרונותיו ומה הוא מכיל?
מולקולת דנ”א מעגלי בעל כושר התרבות באופן עצמאי. מצויה בתא החיידק בכמות גדולה, ואינה מהווה חלק מהדנ”א הכרומוזומלי של החיידק.
משקל מולקולרי נמוך - מולקולת דנ”א קטנה וטבעתית, גודלה עד 10Kbp.
יציבות – דנ”א קטן, אינו שביר במבחנה, צורתו הטבעתית נשמרת.
קל לניקוי והפרדה – עמיד בפני שבירה ונשמר בתהליך ההפקה. כרומוזום החיידק נשבר למקטעים
קוויים. קל להפריד בין מולקולות דנ”א בעלות צורות שונות.
כמות – מייצר העתקים רבים בתא החיידק. הפקה בכמות גדולה מנוצלת לריבוי מקטעי דנ”א
רקומביננטי.
יכולת שכפול עצמאי – לכל פלסמיד יש אזור מוצא ההכפלה – )Origin of replication (ORI, שמאפשר
התרבות עצמית בחיידק.
הפלסמיד מכיל:
מרקרים שיוצרים סלקציה - מכילים גנים לעמידות לאנטיביוטיקה.
פולילינקר – אזור בפלסמיד שמכיל אנזימי רסטריקציה.
אזור מוצא ההכפלה
פרומוטר – קטע דנ”א הקובע את האיבר או הרקמה שבהם ייווצר תוצר הגן, ואת כמות התוצר
שתיווצר בתאים. זהו למעשה רצף דנ”א שעוזר בביטוי הגנים. יש מספר סוגים של פרומטורים, למשל: 40-CMV,SV )נחשב לפרומטור חזק, מבטא טוב מאוד את הגן שאנחנו רוצים(.
מהו pcDNA3.1
פלסמיד מאוד נפוץ, מפיקים אותו בדר”כ מ-E.coli.
יש לו מספר פרומטורים – SV40 ,CMV
פולילינקר – מכיל הרבה מאוד אתרים שבהם אנזימי רסטריקציה, אנזימים שיודעים לחתוך את
הדנ”א באזורים מסוימים.
עמידות לאנטיביוטיקה – מכיל גנים לעמידות בפני אמפיצילין
ונאומיצין.
כיצד מייצרים מפת אנזימי רסטריקציה?
ניתן להפעיל על אותו מקטע של דנ”א מספר אנזימי חיתוך שונים.
מריצים את הדגימות השונות באלקטרופורזה.
זיהוי מקטעי ההרצה יעשה ע”פ UV וע”י אוטורדיוגרפיה.
בעקבות ניתוח של סדרת המקטעים ניתן לשרטט את מפת
ההגבלה של הקטע לאותם אנזימים.
מהם סוגי הקצוות שיכולים להתקבל מחיתוך באנזימי רסטריקציה
קצוות דביקים – מהחיתוך באמצעות אנזימי הגבלה מתקבלים קצוות חד
גדילים המסוגלים להצמיד אליהם דנ”א חד גדילי משלים.
o לוקטורפחותיכולתלהיסגרעלעצמו. o יששליטהעלכיווןהכניסהשלמקטעהדנ”א.
o נצטרךליצורהתאמהביןהגןשנרצהלהכניסלביןהפלסמיד.
נצטרך לחתוך את הדנ”א והפלסמיד באמצעות אותו אנזים רסטריקציה.
קצוות ישרים – חיתוך חלק בציר הסימטריה של אתר ההגבלה יוצר קצוות חלקים )לא דביקים(.
o נוכללהכניסכלמקטעדנ”אשנרצה,העיקרשיהיהחתוךבקו ישר.
מה ההגדרה לדנא רקומביננטי
הגדרה
דנ”א רקומביננטי הוא דנ”א ייחודי שנוצר ע”י חיבור של שני מקטעים שאינם מצורפים יחדיו באופן טבעי.
יצירת דנ”א רקומבינטטי
1. חיתוך שני מקטעים ע”י אותו אנזים חיתוך.
2. חיבור של המקטעים )תהליך זה מתבצע בטמפ’ נמוכות(.
3. איחוי של שני הגדילים בעזרת אנזים ליגאז.
מהי טרנספורמציה
תהליך קליטה של דנ”א זר ע”י תא חי וביטויו. תא שעבר טרנספורמציה הוא טרנספורמנט.
מהו אי קולי ומדוע משמש בטכנולוגיית דנא רקומביננטי
חיידק הצואה. משמש לתהליכי שיבוט –
התרבות מהירה – כל 20 דקות. אם לחיידק גן עמיד לאנטיביוטיקה, נקבל מקטעי דנ”א רבים שבהם הגן שאנחנו רוצים.
תהליך קליטת הדנ”א מאפשר חדירה של מולקולה יחידה בכל תא חיידק.
מסוגל לקלוט דנ”א מכל מקור שהוא.
מגדלים אותו במעבדות במדיום מוצק )אגר( או נוזל.
גודלו 1 מיקרון.
תארי את תהליך הטרנספורמציה
תהליך הטרנספורמציה
תהליך הטרנספורמציה מתבצע בדרך הבאה:
o בידוד הפלסמיד הרצוי מתוך תערובת החיידקים.
o יצירתכמותגדולהשלאותופלסמיד.
קיימות שתי שיטות לביצוע הטרנספורמציה: Electroporation o-הלםחשמלי.בעליעילותגבוהה. o הלםחום–יעילותנמוכה.שמיםבמבחנהדנ”אוחיידקים,למבחנהמוסיפים:
מלח קר – קשירה של דנ”א לממברנת החיידק
חום קצר – התרחבות החורים בדופן החיידקים לכניסת הדנ”א
קרח- התכווצות הממברנה וסגירת החורים
הבדלה בין חיידקים שעברו טרנספורמציה לאלו שלא מתבצעת בשלבים הבאים:
הדגרה
זריעה – את החיידקים שצמחו זורעים בצלחת פטרי שמכילה אנטיביוטיקה.
סלקציה – רק החיידקים שמכילים את הפלסמיד עם הגן העמיד לאנטיביוטיקה ישרדו.
כיצד מפיקים פלזמיד
גידול חיידקים טרנספורמטים ושיקועם באמצעות צנטריפוגה.
ליזיס של תאי החיידקים – פירוק החיידקים בתהליך שהורס את הממברנה שלהם. בתהליך זה
משחררים את הפלסמידים )הפלסמיד לא נפגע מכיוון שזו מולקולת דנ”א מעגלי קטנה ביחס לכרומוזום המעגלי של החיידק(.
רנטורציה של הפלסמיד –איחוי שני הגדילים זה לזה.
הפרדה של הפלסמיד מהדנ”א הכרומוזומלי – נעשה בתהליך אילוציה
o עושיםשימושבקולונה–מבחנהקטנהשיודעתלעשותהפרדהביןהפלסמידלבין הכרומוזום של החיידק.
o מוסיפים את הליזט הצלול על הקולונה )מה שהתקבל כתוצאה מהליזיס של תאי החיידקים(. o שוטפיםאתהקולונהעםתמיסתבופרוכתוצאהמכךמשחרריםאתהדנ”אהרצוילתוך
מבחנה.
שיקוע דנ”א.
ייבוש הדנ”א.
כיצד נבדוק את תקינות הפלסמיד?
נרצה לדעת האם קיבלנו בפלסמידים את מקטע הדנ”א הרצוי.
ראקציית חיתוך עם אנזימי רסטריקציה – מבצעים בפלסמידים חיתוך עם אותו אנזים רסטריקציה שהשתמשנו בו בהתחלה כדי להכניס את הגן הרצוי.
בדיקת התוצרים באלקטרופורזה בג’ל – o נריץאתהדנ”אבג’לעםמרקרדנ”א–מקטעידנ”אבעלימשקלמולקולריידוע. o נשווה את תוצאות ההרצה למרקרים - אנחנו יודעים מה המשקל המולקולרי של הפלסמיד
ושל מקטע הדנ”א שהכנסנו לו, לכן נצפה לקבל בג’ל שני מקטעי דנ”א, קטן – הגן שהכנסנו וגדול – הפלסמיד.
מהם סוגי הנשאים לדנא רקומביננטי
Plasmid
Phase lambda
Cosmid
yeast artificial chromosome
מהו וקטור BAC
וקטור מבוסס על פלסמיד אי קולי
נשא של דנא גדול
יש אחד או שניים בבקטריה
קל לעיבוד
מהו גנום
כל המידע התורשתי של אורגניזם כלשהו המקודד בדנ”א שמרכיב את הכרומוזומים )כלומר רצף זוגות הבסיסים במולקולת הדנ”א שלו(, ומצוי בגרעין התא של כל תא בגופו.
כיצד מייצרים ספרייה גנומית
מפיקים דנ”א מתוך תא וחותכים אותו באמצעות אנזימי רסטריקציה.
o חיתוךחלקישלהדנ”א–משתמשיםבאנזימירסטריקציהבריכוזנמוךכדילאלקבליותר
מדי מקטעים.
עושים חיבור בין הפלסמיד למקטעי הדנ”א שנוצרו באמצעות אנזים ליגאז - נקבל פלסמידים
רקומביננטיים שבהם מקטעי דנ”א בגדלים שונים.
נכניס את הפלסמידים לחיידקים – כל חיידק קולט פלסמיד אחד בלבד.
החיידקים מתחלקים ולכן נוצרים שכפולים רבים של הפלסמידים.
זורעים את החיידקים על מצע אגר ונקבל הרבה מושבות של חיידקים, כאשר כל מושבה מכילה
פלסמיד רקומביננטי אחד בלבד. כל המושבות מהוות ספריה גנומית.
מהו cdna ואיך מייצרים אותו
דנ”א מכיל את כל הגנים, וכולל את כל האינטרונים )שלא מכילים מידע לביטוי גן( והאקסונים. לכן נוכל ליצור ספריה מצומצמת באמצעות mRNA.
יצירת cDNA מmRNA
אנזים רוורס טרנסקריפטאז יודע להפוך רנ”א לדנ”א.
מקור האנזים ברטרו וירוסים – וירוסים שמכילים בגנום שלהם רנ”א ומכילים את האנזים הזה. לאחר השעתוק ההפוך, הדנ”א הוויראלי עובר אינטגרציה עם הדנ”א של התא המאכסן.
יצירת cDNA – באמצעות רוורס טרנסקריפטאז נבנה גדיל חדש של דנ”א מ-5’ ל-3’ על בסיס רנ”א שליח שעבר שחבור.
מנתקים את רנ”א שליח מהדנ”א החדש שנוצר.
על גדיל דנ”א מ-3’ ל-5’ דנ”א פולימראז מסנתז גדיל חדש של דנ”א מ-5’ ל-3’. )קצה 3’ של cDNA
משמש כפריימר(. מתקבל דנ”א דו גדילי מצומצם )ללא אינטרונים( שנוצר על בסיס
mRNA. את הדנ”א שהתקבל חותכים, מחברים לפלסמידים ומחדירים לחיידקים.
מהו גלאי probe
כלי שבאמצעותו אפשר לזהות דנא רקומביננטי
לוקחים מקטע דנ”א חד גדילי קטן, עם רצף נוקלאוטידים
ידוע, שמסומן בחומר רדיואקטיבי.
מערבבים את המקטע הרדיואקטיבי עם דנ”א חד גדילי ונעשה חיבור בין בסיסים משלימים. מתקבל מקטע דנ”א דו גדילי מסומן.
בהליך אוטורדיוגרפיה ניתן לזהות היכן נמצא אותו גן ספציפי שחיפשנו.
תארי את תהליך זיהוי מושבה בעזרת גלאי פרוב
זיהוי המושבה בעזרת גלאי probe לזיהוי גן המבוקש
כאשר יש לנו צלחת עם מושבת חיידקים המכילים דנ”א רקומביננטי, מניחים על גבי המושבות נייר מיוחד הנקרא ניטרוצלולוז.
המושבות יוצרות הדפס על גבי הנייר.
מבצעים ליזיס של החיידקים ודנטורציה של הדנ”א שנמצאים על הנייר.
לנייר מוסיפים גלאי – probe מסומן )מקטע דנ”א קצר מסומן בחומר רדיואקטיבי(. הגלאי נקשר
למושבות ספציפיות המכילות את הגן שנמצא ב-probe.
כדי לזהות את המושבות בהן יש את ה-probe חושפים את הנייר לנייר פילם בתהליך אוטורדיוגרפיה.
המושבות שיופיעו על גבי הפילם הן המושבות המכילות את הגן הרצוי.
תארי את תהליך זיהוי הגן באמצעות תוצר חלבוני
גם לאחר שמוצאים את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד הרקומבננטי, יש עוד מקום לבדוק האם הגן מתבטא בחיידק. תהליך זה יכול להיעשות ע”י זיהוי התוצרים.
תיאור השיטה
יוצרים הדפס של המושבות על גבי ניר ניטרוצלולוז. החלבונים נספחים לנייר.
מדגירים את הנייר עם נוגדן כנגד החלבון )מזהה את החלבון שהגן הדרוש מבטא(. נוגדן תמיד מזהה חלבון )ולא דנ”א(.
מבצעים שטיפה.
מדגירים עם נוגדן שניוני מסומן רדיואקטיבית / פלורוסנטי
)שמזהה את הנוגדן הראשון ומסמן את המושבות הרצויות(.
מבצעים בדיקה באוטורדיוגרפיה.
מהי הכלאה דרומית
שיטה נוספת לזיהוי גנים.
חותכים דנ”א בעשרת אנזימי רסטריקציה ומריצים את מקטעי הדנ”א באלקטרופורזה בג’ל.
מעבירים את מקטעי הדנ”א לניטרוצלולוז )ג’ל הוא חומר רך שקשה לעבוד איתו, נשבר בקלות( ע”י
ספיגה –
o שמיםאתהג’לעלגביספוגדקשנמצאבתוךמיכל
המכיל תמיסה בסיסית.
o עלהג’לשמיםאתהניירניטרוצלולוז.
o עלהניירשמיםניירותסופגיםשמבצעעלייהנימיתשל
התמיסה וכך מעביר את כל המידע שיש בג’ל לניטרוצלולוז.
o כל פסיהדנ”אהחדגדילישהיובג’לעברולניירוהתקבעו עליו.
o מכניסיםאתהניירלשקיתמיוחדתושמיםבהגלאי probe מסומן בחומר רדיואקטיבי, שמתקשר לקטעי דנ”א משלימים.
o חושפיםאתהניטרוצלולוזלניירצילוםבתהליךאוטורדיוגרפיה.עלניירהצילוםמתקבלים פסים שחורים מסומנים שמראים היכן נמצא רצף הדנ”א שחיפשנו.
מה ההבדל בין הכלאה דרומית וצפונית
דרומית זה לדנא צפונית זה לרנא
מהי הכלאה מערבית
מפיקים חלבון, מחממים אותו עד לדנטורציה כדי לקבל מקטעי חלבון. מוסיפים לתמיסה חומר בשם SDS שמונע מהחלבון להתקפל.
מריצים את מקטעי החלבון באלקטרופורזה בג’ל במצב מאונך )ולא מאוזן כמו בכל המקרים האחרים(. ההרצה בג’ל גורמת להפרדה של החלבונים.
בדומה לשיטות הקודמות, מעבירים את המידע בספיגה לנייר ניטרוצלולוז.
מוסיפים נוגדנים ראשוניים שמזהים את החלבון הספציפי אותו רוצים ונקשרים אליו.
מוסיפים נוגדנים שניוניים שמכילים אנזים שמבצע ראקציית אור או צבע.
חושפים את הג’ל לנייר פילם ומשווים את הפסים שקיבלנו למרקרים ידועים על מנת לזהות חלבון
מסוים.
תהליך זה נקרא גם Immunoblotting – מלשון אימונולוגיה, משתמשים בנוגדנים לזיהוי.
הכלאה מערבית – Western Blotting
רק לחלבוניםמ
