תרביות תאים Flashcards
(38 cards)
מה נדרש לתרבית תאים אנימליים
זמן דור בתרבית הוא ארוך, 36-48 שעות
6. דורש מצע גידול מורכב ויקר
7. דורש אוורור )חמצן( – תאים אירוביים
8. דורש בקרת pH, טמפ’ ותנאים סטריליים קפדניים ביותר
9. רוב התאים דורשים משטח תאחיזה בתרבית ויוצרים רובד תאי חד – שכבתי. מיעוט גדל בתרחיף
כמו תאי הדם )לא יוצרים תאחיזה(
מהם סוגי התרביות
תרבית איברים – מקורה ברקמה שלא עברה פירוק )למשל חתיכת שריר מעכבר(. כוללת בתוכה חלק מהמבנה ההיסטולוגי של הרקמה במצב IN VIVO. כלומר בצלחת יגדלו מגוון רב של תאים, מכיוון שרקמת שריר מכילה גם כלי דם, תאי אפיתל, שומן, תאי מערכת עצבים וכו’.
תרבית תאים – מקורה בתאים שנלקחו מרקמה מקורית )ע”י פירוק מכני, אנזימטי או כימי(. נפרק את הרקמה ההתחלתית לתאים בודדים. בצלחת נקבל אוכלוסייה הטרוגנית של תאים.
מהן תרביות ראשוניות ושניוניות
תרביות ראשוניות
מקור התאים ברקמה עוברית או רקמה של אורגניזם בוגר.
מכילות אוכלוסייה הטרוגנית של תאים.
רגישות לזיהומים ולשינויים בסביבת הגידול.
תרביות שניוניות
מקור התאים אינו ברקמה עצמה אלא בתרבית ראשונית.
נקבל אוכלוסיית תאים יותר הומוגנית.
התאים בתרבית בעלי תוחלת חיים מוגבלת.
לאחר מספר חלוקות מסוים עוברים התאים תהליך של הזדקנות תאית ומפסיקים להתחלק.
מהן שורות תאים ומה הקשר לטלומראז?
שורת תאים הם כמעט בני אלמוות.
מתפתחות בעקבות מוטציה ספונטנית או שינוי מכוון, כימקליים מוטגנים, וירוסים אונקוגנים או ביטוי
מלאכותי של גן טלומראז.
o גן הטלומראז מבטא את האנזים טלומראז שמאריך את קצוות הטלומרים בכרומוזומים. לכל
כרומוזום יש רצף של נוקלאוטידים שמגן עליו מפירוק של נוקלאזות. בלי זה כנראה שהדנ”א היה מתפרק. הרצף הזה עם הזמן מתקצר בתאים, ומביא את התא למצב של תמותה )בכל התחלקות יש התקצרות של הטלומר(. אם נבטא את הטלומראז בתרבית תאים באופן מלאכותי הוא יגרום לתאים לשרוד הרבה יותר חלוקות.
תאים בעלי כושר חלוקה גבוה.
עליה במספר התאים במשך מספר דורות.
עליה בדרגת האחידות באוכלוסיית התאים.
קבלת שורת תאים חדשה מלווה בדר”כ בשינויים פנוטיפיים.
קיימות מספר שורות תאים המייצגות סוגים שונים של תאים.
אונקוגן אחד יכול להפוך אותם לתא סרטני.
o בתא סרטני יש חלוקה לא מבוקרת )לעומת שורת תאים אימורטלית שמתחלקת בצורה מבוקרת(. נראה שבתא סרטני נוצרים מוקדים של תאים בצלחת )גידולים לגובה(. תרבית אימורטלית יוצרת רובד חד שכבתי של תאים וכשאין להם מקום להתחלק התרבית מתחילה למות.
אם נבודד תא אחד משורת תאים נוכל לגדל בצלחת מושבה הומוגנית של אותו תא ) Clonal Cell .(Line
מה הגורמים בשינוי התנהגות התא בתרבית?
ניתוק התאים מהמבנה התלת ממדי הגאומטרי וגידולם בסובסטרט דו ממדי גורם להרבה מהשינויים
בהתנהגות התאים בתרבית.
איבוד של אינטרקציות ספציפיות - מבחינה היסטולוגית התאים מאבדים חלק מהמורפולוגיה שלהם, הופכים להיות עגולים ומתחילים להתחלק. עם הזמן מבטאים את אותה יכולת כפי שהייתה בתוך הגוף.
איבוד קומפוננטות ספציפיות חשובות בבקרת התא in vivo, כמו מערכת העצבים והמערכת האנדוקרינית - ללא מעורבות של פקטורים אלה המטבוליזם של התא נעשה יותר קבוע בתרבית
מאשר in vivo לכן אינו מייצג את הרקמה ממנו הוא בא לגמרי )מבטא תהליכים באחוז מאוד גבוה לכן מייצג מספיק טוב לצורך ניסויים(.
מה מרכיב סביבת תרבית. In vitro?
מצע גידול או נוזל – מגדלים את תרבית התאים בצלוחית מיוחדת שנקראת פלאסק ועליה נוזל גידול
מיוחד, או על סקאפולד )פיגום( שעשוי מחומרים סינטטיים או טבעיים ומשמש פלטפורמה להנדסת רקמות. מצע הגידול מכיל פקטורים שונים שיעודדו את התפתחות התאים.
.pH=7.4החומריםהשוניםבמצעעוזריםלשמירהעל o
o חומצותאמינו–פקטוריגידולשמעודדיםגדילהשלהתאים
o פנואירד–אינדיקטורשמשנהאתצבעובהתאםלקצבהגדילהשלהתאים)שינויבחומציות( o סרום–מעודדצמיחהשלתאים.נוזלשקוףשנשאראחריהוצאתקרישדם.מקורויכול
להיות מסוסים, עגלים או עוברים של עגלים. ככל שבע”ח צעיר יותר הסרום שלו מכיל יותר פקטורי גידול. השימוש בסוגי הסרום משתנה לפי מטרת הניסוי.
o אנטיביוטיקה–מטפלתבחיידקים,זיהומיםופטריות.
נוטריינטים – חומרי מזון שנמצאים במדיום הגידול.
סביבה – לחות, CO2, טמפ’ של C ̊37
סטריליות – נשתמש בכלים שייצרו אווירה סטרילית לגדילה של תרבית התאים, למשל אנטיביוטיקה,
מהו מנדף ביולוגי
מנדף ביולוגי
נקרא Laminar Cabinet ובדרך כלל הוא מאונך.
משמש כאמצעי בידוד במעבדה הביולוגית.
מספק תנאי עבודה סטריליים בעת ביצוע העבודה / מחקר.
מונע חשיפה למזהמים ומידבקים לחומרים רעילים.
שימוש עיקרי – גידול תרביות תאים מסוגים שונים.
כיצד המנדף יוצר סביבה סטרילית?
מפוח אחד מזרים אוויר ללא הפסקה דרך 2 מסננים
אספקת אוויר – לוקח 100% אוויר מהמעבדה, מפוח מזרים אוויר סטרילי ללא הפסקה )70%
מהאוויר( נכנס לתוך המנדף ועובר סינון ע”י מסנן
HEPA. פליטת אוויר – 30% מהאוויר עובר סינון נוסף דרך מסנן HEPA ונפלט למעבדה כאוויר נקי.
מסנן HEPA
מוגדר כיעיל לעצירת חלקיקים בגודל 0.3 מיקרון ואף קטנים יותר )משל חיידקים הן בגודל מיקרון לכן לא עובר את המסנן, פחות מצליח לסמן וירוסים(.
מנדף זה מגן על העובד ומיועד לעבודה במיקרואורגניזמים ובתרביות תאים בתנאים סטריליים.
המנדף לא מיועד לעבודה בחומרים רדיואקטיביים ורעלים נדיפים, אלא בכמות מזערית, מכיוון שאין
לו מנגנון שמונע את פליטת חומרים אלה שהם מאוד קטנים.
מהו מנדף ביולוגי כימי
משלב עבודה עם תרביות תאים ועם חומרים כימיים. 100% מהאוויר שנכנס למנדף נשאב החוצה מהמעבדה ויוצא דרך ארובה מחוץ למעבדה.
מהו אינקובטור לתרבית תאים?
מכשיר שתפקידו לספק לתרביות התאים תנאים אחידים של גידול:
טמפ’ - תרביות תאים של בע”ח )תאים אנימליים( מגדלים לרוב ב- C ̊37
חומציות - ריכוז CO2 משפיע על רמת pH של מצע הגידול הנוזלי כך שהוא נשמר בסביבת 7=pH. אם
ה-pH משתנה צבע המדיום בו גדלים התאים משתנה. מדיום אדום שמשנה צבעו לסגול מעיד על pH בסיסי )גבוה(. אם המדיום משנה את צבעו לצהוב מעיד על pH חומצי )נמוך(ף במצב כזה ניתן
להסיק שהתאים התפתחו וכיסו מרבית מהמשטח, לכן יש להחליף להם מצע או לפצל אותם. שינוי בחומציות יכול לגרום לתאים לעקה.
לחות – 90%. מים שומרים על הלחות.
o חוסרלחות–יובשבצידיהתרבית,התאיםיגדלורקבמרכז.
o עודףלחות–מעל95%התאיםיגדלובכלהכיוונים.
מהו מיקרופלזמה
החיידקים הפשוטים והקטנים ביותר שקיימים. חסרי דופן תא )ולכן אנטיביוטיקה לא הורגת אותו מכיוון שהיא פועלת על הדופן( ובעלי גנום קטן מאוד המאפשר את פעולות החיים הבסיסיות ביותר. חיים כטפילים, אינם פולשים לתאים אחרים אלא חיים מחוץ להם על גבי ממברנת התא.
בסה”כ קיימים כ-100 מיני מיקופלזמה. שני מינים של מיקופלזמה גורמים למחלות באדם:
1. M.pneumoniae – גורם לחלק נכבד ממקרי דלקת ריאות
2. M.genitalium – גורם לדלקות באיברי המין
חיידקי המיקופלזמה יכולים לזהם תרביות תאים במעבדות. לא ניתן לראותם במיקרוסקופ אור בשל גודלם הקטן והם עמידים בפני סוגים רבים של אנטיביוטיקה. זיהום תרבית במיקולפלזמה עלולה לתת תוצאות שגויות במחקר בו משתתפת התרבית.
כיצד מזהים זיהום מיקרופלזמה?
לוקחים דגימה מתרבית ומשכפלים אותה באמצעות PCR.
מבצעים חיתוך באמצעות אנזימי רסטריקציה.
מנתחים את התוצאות בעזרת אלקטרופורזה.
משווים את התוצאות עם ערכים ידועים של גנום המיקופלזמה, מה שמאפש זיהוי של הזיהום. גודל הגנום של המיקופלזמה נע בין 600,000 ל-1,300,000 בסיסי דנ”א. לצורך השוואה, הגנום של E.coli
הוא כ-4.5 מיליון בסיסי דנ”א.
מהם שלבי התחלת גידול התרבית
הפשרת תאים
כשרוצים להתחיל לגדל תרבית תאים, נרצה להתחקות אחר הגידול שלה. לכן ניקח אמפולה – מבחנת הקפאה קטנה, נוציא ממנה תאים ונגדל אותם בתנאי מעבדה.
מומלץ לבצע הפשרה מאוד מהירה של האמפולה לתוך מדיום הגידול המותאם לה, מכיוון שבתהליך ההקפאה יש חומרים שמגנים על התרבית בזמן ההקפאה וכשהתאים האלה מופשרים חומרים אלה יכולים לפגוע בהם. לכן ההפשרה צריכה להיות מהירה כשאת התאים מקיף מדיום גידול חם שמבודד אותם מאותם חומרים ומונע מהם לפגוע בתאים בתהליך ההפשרה.
את ההפשרה ניתן לבצע גם באמצעות סרכוז ולהשתמש במשקע שם נמצאים התאים.
הזרעה
לאחר שהתאים מופשרים הם מתחילים לתקן את עצמם ויוצרים תאחיזה בתוך הצלחת העשויה פוליאסטרן )פלאסק או צלחת פטרי(. התאים מתחילים לגדול באופן אקספוננציאלי עד שהם מגיעים למצב של קופלואנטיות.
קופלואנטיות – מצב שבו התאים מכסים את שטח הצלחת. על סמך היחס בין השטח המכוסה בתאים לחשוף נוכל לאמוד את רמת הקופלואנטיות. ב-100% קופלואנטיות נרצה לפצל את התאים לכמה תרביות.
Contact Inhibition – לתאים יש גידול מבוקר )בניגוד לתאים סרטניים בהם יש חלוקה לא מבוקרת(. התאים גדלים ובאים במגע אחד עם
השני, המגע ביניהם גורם להפסקת הגדילה )במידה ואין להם מקום לגדול בכיוונים שונים( והתאים נכנסים למצב פלטו. אם לא נפצל אותם התאים יתחילו למות.
מהי התמיינות תאים
תהליך שבו תא באורגניזם רב תאי מקבל תפקיד מוגדר ורוכש תכונות המשמשות אותו לתפקיד זה. המורפולוגיה של התא יכולה להשתנות באופן משמעותי במהלך ההתמיינות. החומר הגנטי נשאר זהה, מלבד מספר תאים יוצאי דופן )גמטות - תאי המין שונים במטען הגנטי בגלל תהליך השחלוף(.
תהליך ההתמיינות של התאים לרקמות שונות נגרם מהפעלה ושיתוק של גנים שונים, עפ”י התפקיד שעל הרקמה לבצע.
מתי מתרחשת התמיינות תאים
מקורם של כל סוגי התאים השונים בגוף הוא בביצית מופרית – זיגוטה.
שלב הבלסטולה - לאחר ההפריה מתחילה הזיגוטה בחלוקה לתאים זהים. בשלב זה מתחילה התמיינות התאים.
שלב הגסטרולה - יש חלוקה לשכבות שונות שיתפתחו למערכות של העובר:
1. אקטודרם – שכבה חיצונית ממנה יתפתחו מערכת העצבים, עור, איברי חישה, שיניים, שיער, ציפורניים וכו’.
2. מזודרם – שכבה אמצעית ממנה יתפתחו שריר, שומן, סחוס, עצם, דם, כליות, אברי מין, רקמת חיבור.
3. אנדודרם – שכבה פנימית ממנה יתפתחו מערכת העיכול, כבד, כיס מרה, לבלב, דרכי שתן, סימפונות ונאדיות.
התמיינות התאים מתרחשת גם במהלך חייו הבוגרים של האורגניזם, תאים אלו בבע”ח נקראים תאי גזע.
הם תאי גזע
תאי גזע – תאי אב, תאים ראשוניים של הגוף שמהם יכולים להתפתח סוגים שונים של תאים. תאי הגזע )תאי אלמוות( שונים משאר תאי הגוף ומאופיינים בשתי תכונות עיקריות:
1. אינם תאים ממוינים.
2. מתרבים ומתחלקים ללא הגבלה.
מחקר תאי הגזע טומן בחובו תקוות לפתרונות ויישומים רפואיים חדשים למחלות חשוכות מרפא ובמחלות בהן נגרם נזק או הרס לתאים ורקמות.
מהם תאי גזע עובריים
מסה של תאים פנימיים מהבלסטולה.
שלב המורולה - התאים הראשונים שמתחלקים מהזיגוטה )לאחר ההפריה( עד 16 תאים. אלה תאים טוטיפוטנטים, כלומר שאם נגדל כל אחד מהתאים האלה בצלחת נפרדת, נקבל מכל אחד מהם עובר שונה. עובר יכול להתפתח רק אם יש שליה ורקמה.
שלב הבלסטוציט – התאים ממשיכים להתחלק. בשלב זה נקבל מעין כדור חלול, כלומר רובד חד שכבתי של תאים שבתוכו צבר של תאים. אם ניתן לבלסטוציט להתפתח ולהתחלק נקבל עובר שלם.
o טרופובלאסט-הרובדהחדשכבתיממנומתפתחתהשליה.
Inner Cell Mass o – תאי הגזע. תבר התאים ממנו מתפתח העובר. מתפתח העובר, אלה
תאי הגזע.
כיצד מגדלים תאי גזע במעבדה?
מבודדים את צבר התאים הפנימי )תאי הגזע(.
את צבר התאים מגדלים בצלחת פטרי.
תאי גזע עובריים דורשים מצע הזנה כדי לגדול ולהתפתח.
o מצע זה נקרא feeder cells - מקורם בתאים פיברובלסטים של עכבר שעברו הקרנה.
o מצעהזנהשמקורומעכבריכוללהיותבעייתימכיווןשאםנרצה להשתמש בתאים לטיפול בבני אדם, יכול להתפתח זיהום. תהליך ההקרנה אמור לגרום לתאים לא להתחלק ומכאן לא להשפיע על תאי העובר.
התאים גדלים ויוצרים מוקדים בצלחת.
מהן הבעיות בטיפול בתאי גזע עובריים
-טראטומה – גידול שפיר שמתקבל לאחר הזרקה של תאי גזע ליצור חי אחר. הטראטומה מורכבת
משלוש השכבות הבסיסיות של העובר,. מכיוון שהפרדנו את צבר התאים מהשליה לא יכול להתפתח עובר, אך יכולים להתפתח אברונים, דבר שמהווה בעיה כאשר רוצים להשתמש בתאי הגזע לריפוי )רוצים תאים שלא התמיינו(.
דחיית שתל – מקור התאים בזיגוטה מסוימת שהתקבלה מהורים מסוימים. כאשר נשתיל את התאים לאדם אחר לא בטוח שהם יתאימו לו. בשנים האחרונות הצליחו להתגבר על הבעיה הזו.
בעיה אתית – לפי תפיסת הכנסייה הקתולית ברגע ההפריה נוצרים חיים. ברגע שלוקחים עובר בן כמה ימים זה נחשב לרצח. )למשל: ג’ורג’ בוש הספיק את מימון המחקר בתאי גזע עובריים(. לפי תפיסת היהדות עובר עד 40 יום לא נחשב חי ולכן אפשר להשתמש בו לצרכי מחקר או הפריה. ביום ה-41 שומעים לראשונה דופק.
מהם תאי גזע בוגרים?
תאים לא ממויינים
מצויים בכל רקמות הגוף של אדם בוגר. תפקידם העיקרי ברקמה:
o שמירה על הומאוסטאזיס – ויסות ובקרה של תהליכים תקינים של הרקמה.
o החלפת תאים חולים או מתים.
בעלי יכולת לייצר העתקים זהים של עצמן למשך זמן רב.
תאים נדירים – קיימים תאים בודדים בכל רקמה ולרוב קשה לזהות אותם )1 מתוך 10,000-15,000
תאים במח העצם הוא תא המטופוייטי – תאי גזע שמייצרים תאי דם(.
דחיית שתל מינימלית אם התאים נלקחים מהחולה עצמו – השתלה אוטונומית )אם אין מחלות רקע(.
לא קיימת יצירת טראטומות )גידולים שפירים(.
Plasticity – חלק מתאי הגזע יכולים להתמיין לתאי רקמה השונים מהרקמה שמהם נוצרו.
Totipotent Cells
יכולת של התא )כמו תא ביצה מופרית, זיגוטה או מורולה – עד 16 תאים עובריים( להתמיין לכל אחד מסוגי התאים בגוף הדרושים ליצירת אורגניזם שלם ומתפקד )tissue+placenta(.
יכול להתמיין לעובר שלם )רקמה+שליה(, נוצר כתוצאה מהפריה של ביצית ע”י זרע.
Pluripotent Cells
המסה הפנימית של התאים = תאי גזע עובריים = תאים פלוריפוטנטים. תאים אלו בעלי יכול להתפתח לכל סוג תא שמקורו באחת משלושת השכבות העובריות.
– יכול להתמיין לכל סוג רקמה פרט לשליה.
Multipotent/Unipotent Cells
מתייחס גם לתרי גזע עובריים וגם לבוגרים. תאי גזע עוברים “התמחות” נוספת לתאי גזע ספציפיים בעלי תפקידים מסוימים בגוף: תאי דם, תאי עצב, שריר, עור וכו’. תאי גזע מולטיפוטנטים ניתן למצוא במספר סוגי רקמות של אדם בוגר. למעשה, אלו אותם תאים שנדרשים על מנת לחדש כל הזמן את ייצור התאים בגוף. התאים המולטיפוטנטים הללו שוכנים בגוף האדם לכל חייו וחשובים לתפקודו אצל ילדים ומבוגרים כאחד. לתאי הגזע המולטיפוטנטים בגוף הבוגר מייחסים Plasticity.
Plasticity
יכולתם של תאי גזע בחלק גוף אחד “להתמחות” בתנאים מתאימים לסוג אחר של תא אליו לא היה מתפתח באופן טבעי. למשל: תאי גזע במח העצם שתפקידם כמקובל ליצור תאי דם, יכולים להתפתח לתא שריר הלב, עצב, סחוס, תאי שומן או תאי כבד.
Teratoma
גידול שפיר שמורכב מרקמות שמקורן בשלושת השכבות העובריות הבסיסיות אקטודרם, מזודרם ואנדודרם. הטראטומה מתקבלת לאחר הזרקה של תאי גזע פלוריטפוטנטים לחיות, במטרה לקבוע יכולות של תאי גזע לעבור התמיינות לסוגים שונים של רקמות.
