מיקרוסקופיה וצביעות

Question 1

הטרוכרומטין

Answer 1

כרומטין שאינו פעיל. תאים שאינם מפיקים חלבונים או מעט.

ייראה כעגול, מלא, ומכונס.

Question 2

אאוכרומטין

Answer 2

כרומטין פעיל. ייראה פתוח, שכן הוא פעיל ויהיה בתאים פעילים.

Question 3

השכבות העובריות

Answer 3

אקטודרם
מזודרם
אנדודרם

Question 4

אקטודרם

Answer 4

מחוץ לעור.
יתמיין לשכבות חיצוניות של הגוף ומע’ העצבים.

Question 5

מזודרם

Answer 5

העור האמצעי.
יתמיין לרקמת חיבור, שריר, והשלד הפנימי.

Question 6

אנדודרם

Answer 6

העור הפנימי.
יתמיין לתעלות, כלי העברה, מעיים, ריאות.

Question 7

באזופילי

Answer 7

הימשכות לבסיסיות, צובע מבנים כמו

DNA/RNA וחלבונים ספציפיים.
ליזוזומים
נצבע עם המטוקסילין.

Question 8

אאזינופילי

Answer 8

הימשכות לחומצה, צובע מבנים כמו חלבוני ציטופלסמה.
מיטוכונדריה
נצבע עם אאוזין.

Question 9

שיטות מיקרוסקופיה עיקריות

Answer 9

מיקרוסקופ אור
מיקרוסקופ פלורסנט
מיקרוסקופ אלקטרוני (סורק+חודר(

Question 10

סוגי הרקמות שמעניקות לתאים מאפיינים כלליים

Answer 10

אפיתל
רקמה חיבורית
שרירים
רקמת עצב

Question 11

יתרון/חיסרון צביעה הסטולוגית רגילה

Answer 11

יתרון - באמצעות שילוב שני צבעים בלבד, ניתן לראות מגוון צבעים המעידים על מרכיבים שונים.

חיסרון - אי אפשר לתת המלצה לגבי צורת הטיפול, שכן אין מספיק מידע על הרכיבים ברמה המולקולרית.

Question 12

הפרפרציה/תהליכים שעוברת הרקמה

Answer 12

קיבוע - Fixation
חיוך למקטעים - Sectioning
צביעה - Staining

Question 13

רזולוציה

Answer 13

המרחק הקטן ביותר בין שתי נקודות שניתן להבחין ביניהן כאשר מגדילים אותן. זהו כושר ההפרדה של המיקרוסקופ.

ככל שאורך הגל קצר יותר הרזולוציה גבוהה יותר

Question 14

ניגודיות

Answer 14

מאפשרת לנו לשלוט בכמות האור וכך להבחין בפרטים בדוגמה - “לא להסתנוור”.

Question 15

שיטות אופטיות להגברת ניגודיות

Answer 15

Bright field - סלייד לא צבוע, בתצוגה רגילה של מיקרוסקופ אור.

Dark field - הארה בזוית קיצונית
לקבלת קונטרסט גבוה יותר במחיר איבוד פרטים.

Phase contrast - ניגודיות פאזות, מנצל את ההבדלים הזעירים בשבירת האור בין תאים חיים לסביבתם ומתרגם ההבדלים לניגודיות. שימושי לצפייה בתאים חיים ואברונים.

DIC (Differential interference contrast) - ניגוד התערבות דיפרנציאלי, שימוש בפריזמות להפרדת קרני אור מקוטבות מאזורי דגימה אחרים. מתבסס על שימוש במד איבוך ליצירת תמונה דמויית תלת-מימד, עם ניגודיות פשוטה ורזולוציה מצוינת.

התאבכות - מעצים את הניגודיות
באמצעות חיבור גל שעובר דרך הדוגמא עם גל עם גל שלא עובר דרך הדוגמא.

כיוון ההארה יכול להיות פרמטר לניגודיות.

Question 16

מיקרוסקופ אור

Answer 16

מקור - אור לבן

עדשות - זכוכית

דגם - חי/עבר פיקסציה

הכנה - אין/ רק צביעה

תמונה - דו-מימד

רזולוציה - 0.2 מיקרומטר

איך עובד - בליעה של האור ופיזורו באופו שונה בכל אחד מחלקי האובייקט

Question 17

מיקרוסקופ פלורסנטי

Answer 17

מקור - אור מונוכרומטי

עדשות - זכוכית+ציפוי

דגם - חי/ עבר פיקסציה

הכנה - צביעה

תמונה - דו/תלת מימד

רזולוציה - 0.2 מיקרומטר

איך עובד - החזרה פלורוסנטית

Question 18

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק

Answer 18

מקור - קרן אלקטרונים

עדשות - אלקטרו-מגנט

דגם - עבר פיקסציה

הכנה - ציפוי זהב

תמונה - תלת מימד

רזולוציה - 10 ננומטר

איך עובד - פיזור אלקטרונים חוזרים

Question 19

מיקרוסקופ אלקטרוני חודר

Answer 19

מקור - קרן אלקטרונים

עדשות - אלקטרו-מגנט

דגם - עבר פיקסציה

הכנה - ציפוי שכבה דקה מוליכה

תמונה - דו מימד

רזולוציה - 0.2 ננומטר

איך עובד - פיזור אלקטרונים עוברים

Question 20

מבנה מיקרוסקופ אור

Answer 20

אובייקטיב
אוקולור
מקור האור
קונדנסר

Question 21

אובייקטיב

Answer 21

עדשת העצם - העדשה שמעל לאובייקט.
היא שיוצרת את התמונה הראשונית המוגדלת של הדוגמא.
בנויה ממספר עדשות, מקור האור מגיע מהכיוון הנגדי לאובייקטיב ובכך נוצרת הדוגמא המוגדלת.

Question 22

אוקולור

Answer 22

עדשת העין - עדשה שיושבת מעל האובייקטיב במרחק נתון בכדי ליצור דוגמא אופטימלית וכן להגדיל שוב את הדוגמא.
עדשת העין נמצאת בצינור ההתבוננות (observation tube).

Question 23

מקור האור

Answer 23

נמצא בבסיס המיקרוסקופ.
ייתכן שיהיה מעליו צמצם (iris diaphragm) שיכול לסנן את עוצמת האור שעוברת.

Question 24

קונדנסר

Answer 24

מעבה - עדשה שנמצאת מתחת לאובייקט ומעל למקור האור.
מפקס את האור.
לוקח את האור ממקור האור ומעביר אותו כך שכל הקרניים יהיו מקבילות והתמונה תהיה מוארת באופן שווה.

Question 25

נקודה פוקלית / נקודת הפוקוס

Answer 25

הנקודה בה קרני האור פוגעות בתמונה. כך תואר כל הרקמה באופן מיטבי.

Question 26

הכנת דגמים (פרפרט) למיקרוסקופ אור

Answer 26

1. לקיחת דוגמה מחיה מורדמת/ככל האפשר קרוב למוות. 2. חתכים (section) דקים שמאפשרים מעבר אור ומסתירים אור בנקודות שונות. עובי חתך 5 מ"מ. 3. שימור חתכים ותאים באמצעות פיקסציה (fixation). 4. חתך סדרתי (serial section) - סדרה של חתכים עוקבים לקבלת מבנה תלת-מימדי. 5. הגברת ניגודיות באמצעות שיטות אופטיות וצביעה.

Question 27

הגברת ניגודיות על ידי צביעה

Answer 27

שיטות שמבוססות על קשרים כימיים בין מולקולות. אימונוהיסטוכימיה - שימוש בנוגדנים צבועים כדי לסמן חלבונים ספציפיים.

Question 28

דרכי פיקסציה/קיבוע

Answer 28

קיבוע כימי - שמירה על הרקמה שלא תרקב. התהליך לוקח זמן. נשים אתה רקמה בחומרים כימיים שמשפיעים על החלבונים והמבנה שלהם כדי שהם לא יעבדו (דנטורציה). נכניס את הרקמה בזהירות לממס אורגני שיעצור את התהליכים. בעיה אפשרית: בשיטה זו עלולה להיווצר הקשחה ועיוות הדוגמא. דוגמאות לחומרים משמרים: פורמלין, פורמאלדהיד, אלכוהול, אצטון, חומצה פיקרית. פיקסציה בהקפאה - נעשית בקריאוסטט על ידי גז דחוס. תהליך מהיר מאוד. במקרה זה אין דנטורציה והחלבונים נשמרים כפי שהיו ברקמה החיה. בעיה אפשרית: החיתוך מתבצע בטמפ' נמוכה וזהו חיתוך גס יותר שיוביל לאיכות חתך ותמונה נמוכים. אין אפשרות לחתכים סדרתיים. הקרח מתנפח ועלול לגרום לחתכים ברקמה.

Question 29

הקשחה/embedding

Answer 29

בשל הפיקסציה הרקמה מכילה נוזלים רבים. לא נוכל לחתוך אותה אופן מדויק כך ולכן נידרש להפוך אותה לקשיחה. הוצאת המים מהרקמה נעשה בשני שלבים: 1. שטיפות בחומר הידרופובי בריכוז עולה (כמו אלכוהול). 2. שטיפה בממס אורגני לניקוי משומנים (כמו קסילן). נטביע הרקמה בחומר שיתן קשיחות - לא רלוונטי אם ביצענו פיקסציה בקור שכן היא כבר קשיחה. החומר יחלחל פנימה לרקמה ויחליף את המים, ימלא חללי הנוזל ויתקשה. יבוצע עם חומרים כמו פראפין, שעוה, פלסטיקים מסוימים.

Question 30

חיתוך

Answer 30

לאחר ההקשחה ניתן לחתוך את הדוגמא. ככל הדוגמה קשיחה יותר כך החיתוך יהיה מדויק ואיכותי. פורסים את הדוגמה לפרוסות באמצעות מיקרוטום שפורס לפרוסות דקות בעובי של 1-10 מיקרומטר. הפריסה נעשית במים בכדי לשמור שהטמפ' לא תעלה. מתקבלת פרוסה שכעת נרצה להיפטר מחומר ההקשחה שהשקענו בה, משום שהוא יחסום את האור. נבצע רה-הידרציה של המים על ידי שני שלבים: נעלה בהדרגה ריכוז הממס האורגני כדי לשטוף את חומר ההקשחה, ואז שוטפים במים. כך מחליפים את חומר ההקשחה בממס האורגני חזרה כדי שיראה היטב.

Question 31

צביעות מיוחדות

Answer 31

Mason trichrome - תערובת 3 צבעים שתסייע להבחין בין מבנים תאיים לחוץ-תאיים. נשתמש בצבע ירוק בהיר, המטוקסילין, וחומצת fuchsin. ייראה טוב ברקמה חיבור. Mallory-Azan trichrome - תערובת 3 צבעים. טוב להדגיש סיבי קולגן בכחול/גרעין אדום/שריר אדום/תאי דם אדומים אדום. סיבי קולגן נצבעים בירוק או כחול/ שריר וקראטין יהיו אדומים/ציטופלסמה תהיה ורודה אדומה/ גרעינים יהיו שחורים. Leishman / Giemsa - להפרדה בין תאי הדם. ערבוב של תמיסת מתילן-בלו עם אאוזין והמסתם לpH ניטרלי. Silver impregnation - השקעה של יוני כסף, אלמנטים רקמתיים מסוימים הופכים בולטים. מעולה להפרדה בין סיבים של רקמה חיבורית, נצמד לסיבים הרטיקולריים בשחור/ רכיבי רקמה אחרים נצבעים בצביעה נגדית לתת רקע ורוד או כחול. צובע גם תהליכים נוירונאליים. Azure A - צבע ממשפחת האנילין. צביעה מטה-כרומטית של מוקופוליסאכרידיים. Perioidic Acid Schiff (PAS) - צביעה של מול' מסוימות שנחפש ברקמה. צובע ריר בתאי גובלט, גרנולות בתאי מאסט, למינה בזאלית, טוב להפרדת ציטופלסמה מסיבי רקמה חיבורית. צבוע פחמימות (סוכרים גדולים) באדום. Alcian Blue - צביעה של מוקופוליסאכרידיים בכחול-ירוק. צבע טעון חיובי Elastic Stain - צביעה של סיבים אלסטיים בעזרת החומרים fuchsin, orecein. אלסטין נצבע בסגול כהה. Sudan black - צביעה של שומן על ידי ספיגה, דורש קיבוע בהקפאה. Osmium tetroxide - מתחבר לליפידים, צובע שומנים. יוצר חומר שחור שנראה בקלות, ומבצע פיקסציה של השומנים. Luxol fast blue and Cresyl violet (cationic) - צביעה של מיאלין בכחול/ וגופיפי ניסל (ניסל בודיז) באדום. לא מסיס במים וחודר לתוך התא לאורך זמן. Trichrome stain - משמש לזיהוי שריר, סיבי קולגן ופיברין. צביעה המשלבת שימוש בחומרים שונים שחלקם מעכבים אפקט הצבע מאלמנטים מסוימים.

Question 32

צביעות מיקרוסקופ פלורסנטי

Answer 32

אימונולוגית/אימונוהיסטוכימיה - מכוונין נוגדן צבוע לחלבון וכך נזהה אותו. שיטה זו משתמשת ביכולת הגוף ליצור נוגדנים. הנוגדן נדבק רק לחלבונים שיעניינו אותנו ונוכל לזהותם. ניתן גם לייצר נוגדן ספציפי לחלבון (נוגדן שניוני) נגרום לחיה אחרת לייצר נגודן מוסמן כנגד נוגדני חיה אחרת. באופן זה לא צריך לסמן כל נוגדן ספציפי באופן פלורוסנטי. GFP (green fluorescent protein) - מייצרים בע"ח שמבטאים חלבון זה שמקורו במדוזות . ניתן לשלב את הגן הפלורוסנטי עם הדנ"א של תאים ספציפיים או בנסיבות מסוימות. אם נשלב כך את הרצף של GFP לDNA של חלבון אחר נקבל חלבון עם זנב של GFP. לרוב הוא לא יפגע בתפקודיות החלבון, אך יאירו היטב.