Séances 3 et 4 : ELISA

Question 1

Que veulent dire les lettres de ELISA?

Answer 1

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Question 2

Sur quoi est basé l’ELISA?

Answer 2

Essai basé sur la liaison Ag-Ac dans lequel une des molécules est fixée à un support solide (phase solide) et dont la détection repose sur l’activité d’une enzyme

Question 3

Que permet l’ELISA?

Answer 3

Détecter ou doser des substances biologiques principalement de nature protéique

Question 4

Pourquoi l’ELISA est l’essai le plus largement utilisé?

Answer 4

À la fois sensible et spécifique et simple à réaliser

Question 5

Quels sont les 2 grands types d’ELISA?

Answer 5

Indirect et direct

Question 6

Quelle est la différence entre l’ELISA direct et indirect?

Answer 6

Direct : Ac immobilisé à la phase solide

Indirect : Ag immobilisé

Question 7

À quoi sert l’ELISA de type indirect?

Answer 7

Détecter l’Ac correspond à l’Ag immobilisé sur la phase solide

Question 8

Si un Ac peut être immobilisé sans que sa reconnaissance à l’Ag ne soit affectée, quel type d’ELISA peut être mis au point pour détecter la présence de l’Ag?

Answer 8

ELISA de type Sandwich

Question 9

Quel type d’essai est utilisé pour détecter les Ac anti-VIH présents dans un sérum?

Answer 9

ELIA de type indirect

Question 10

Quel type d’essai est utilisé pour détecter des cytokines lors d’une réponse immunitaire?

Answer 10

ELISA de type sandwich

Question 11

Qu’est-ce qui permet le fait qu’on peut détecter une substance biologique?

Answer 11

Le fait qu’une enzyme peut être couplée à un Ac sans affecter l’activité de chacun : enzyme catalyse la formation d’un produit qui peut être facilement détecté et dosé

Question 12

Comment peut-on nommer l’anticorps couplé à l’enzyme?

Answer 12

Ac de détection ou Ac secondaire

Question 13

Qu’est-ce que l’Ac secondaire reconnaît?

Answer 13

Ac à doser (Ac primaire) ou Ag directement

Question 14

Comment peut-on mesurer le produit coloré formé par la réaction?

Answer 14

Par spectrophotométrie

Question 15

Pourquoi dit-on que l’essai est quantitatif?

Answer 15

Puisque l’intensité de la coloration observée est proportionnelle à la quantité d’Ac (ou Ag) présente.

Question 16

Pourquoi l’ELISA serait-il difficile, voire impossible sans immobilisation?

Answer 16

Car chaque composante est ajoutée une après l’autre et cela est suivi de plusieurs lavages (un à chaque composante ajoutée) afin de se débarrasser des molécules non liées.
Sans immobilisation, les composantes qu’on veut mesurer seraient simplement lavées

Question 17

Quels sont les matériaux les plus populaires comme phases solides?

Answer 17

Billes, disques, éprouvettes, microplaques en polystyrène ou en polyvinyle

Question 18

Quels facteurs sont importants pour optimiser la liaison à la plaque?

Answer 18

Type de tampon
Quantité d’Ag
Température
Durée du traitement

Question 19

Comment contre-t-on le problème que les Ac ont tendance à s’attacher de façon non spécifique au plastique ou aux substances qui y sont fixées?

Answer 19

Saturer la plaque d’une protéine qui n’est pas impliquée dans la réaction Ac-Ag (étape de blocage)

Question 20

Quelle protéines utilise-t-on généralement pour le blocage?

Answer 20

Gélatine de poisson, caséine ou BSA

Question 21

Pourquoi la BSA ne peut pas être utilisée comme protéine de blocage dans l’essai que nous avons fait en laboratoire? (question stupide!)

Answer 21

Car nous analysons des Ac anti-BSA (la BSA est utilisée comme protéine pour capter les Ac)

Question 22

Qu’est-ce qui est important de faire entre chaque ajout de réactif?

Answer 22

Retirer complètement l’excès d’un réactif avant d’en ajouter un autre

Question 23

Comment contre-t-on les liaisons faibles non spécifiques?

Answer 23

En mettant un détergent (Tween-20) dans la solution de lavage et en mettant la protéine inerte ayant servi au blocage ainsi que le détergent dans pratiquement toutes les solutions utilisées

Question 24

Quelles sont les enzymes les plus souvent couplées aux Ac de détection?

Answer 24

Peroxydase, phosphatase alcaline et la bêta-galactosidase

Question 25

Quelles sont les caractéristiques idéales pour l’enzyme couplée et son substrat?

Answer 25

Enzyme : stable et très active

Substrat : stable, peu dispendieux et non toxique

Question 26

Quelles seront les caractéristiques du produit formé?

Answer 26

Soluble et de couleur intense

Question 27

Quels sont les critères permettant de déterminer l’enzyme à utiliser pour l’essai?

Answer 27

Niveau de sensibilité souhaité

Rapidité de réaction

Question 28

Quelle enzyme et quel substrat ont été utilisés dans l’essai effectué au laboratoire?

Answer 28

Peroxydase et substrat tétraméthyl benzidine (TMB)

Question 29

Comment dilue-t-on les Ac à doser et comment calcule-t-on habituellement la valeur du titre?

Answer 29

Dilués en série doublante ou décimale

Titre calculé à partir de la courbe standard d’un Ac connu

Question 30

Si le titre ne peut pas être calculé selon une courbe standard, comment le calcule-t-on?

Answer 30

En trouvant la dilution ultime donnant encore une absorbance supérieure au seuil de positivité

Question 31

Comment calcule-t-on le seuil de positivité dans notre essai?

Answer 31

Positif si : A450 avec Ag - A450 sans Ag > 0,2

Question 32

Comment se nomme la courbe formée par la méthode graphique?

Answer 32

Courbe sigmoidale

Question 33

Quelles sont les trois zones de la courbe formée par la méthode graphique?

Answer 33

Zone de dilutions linéaires de l’Ac
Zone d’excès d’Ac
Zone d’excès d’Ag

Question 34

Quelle zone est utilisée pour la détermination du titre par la méthode graphique?

Answer 34

Zone de dilutions linéaires

Question 35

Comment détermine-t-on le titre par la méthode graphique?

Answer 35

Seuil de positivité déterminé par le point de rencontre entre la prolongation de la portion linéaire et la courbe du témoin sans Ag : titre = dilution ultime donnant encore une absorbance supérieure au seuil de positivité (titre = inverse de la dilution qui précède le point de rencontre)

Question 36

Quels sont les deux antisérums testés dans l’essai effectué au laboratoire?

Answer 36

Antisérum de lapin prélevé suite à une immunisation avec le BSA
Extrait d’IgY (Ac purifiés à partir du jaune d’oeuf d’une poule également immunisée avec le BSA)

Question 37

Quels sont les 3 témoins à effectuer pour l’essai?

Answer 37

Sans Ag
Sans Ac primaire
Sans Ac primaire et secondaire

Question 38

Que doit-on ajouter à la solution de blocage lorsque le blocage dure plus de 24h?

Answer 38

Azoture de sodium (NaN3) (toxique!!!)