Séances 5 et 6 : Analyse de lymphocytes par cytométrie de flux

Question 1

Quel est le nom anglais pour cytométrie de flux?

Answer 1

FACS (fluorescence activated cell sorter)

Question 2

Selon quels paramètres le FACS peut-il discriminer les cellules d’une suspension?

Answer 2

Taille
Forme
Nombre
Certaines composantes cellulaires

Question 3

Décrire très généralement le principe du FACS.

Answer 3

Principe repose sur la séparation des cellules dans un fluide et sur les modulations d’un rayon laser provoquées par les cellules qui le traverse une à une

Question 4

Comment un flux continu de cellules séparées les unes des autres est-il créé?

Answer 4

Le fluide entraîne une suspension cellulaire à travers une buse, la réduisant en de très fines gouttelettes (ainsi le flux continu de cellules séparées est créé)

Question 5

Où passent les gouttelettes ensuite?

Answer 5

Passent à travers un rayon laser qui est dévié proportionnellement à la taille et la forme des cellules

Question 6

Si un marquage a été réalisé avant l’essai, qu’est-ce qui est produit et détecté?

Answer 6

Fluorescence

Question 7

Doit-on utiliser un seul colorant fluorescent?

Answer 7

Non, on peut en utiliser plusieurs si l’appareil est muni des détecteurs appropriés

Question 8

Décrire rapidement comment nous allons réaliser le FACS.

Answer 8

Ac monoclonaux conjugués à un colorant fluorescent lient spécifiquement des Ag de surface des cellules : «Étiquetage» permet ensuite l’identification des cellules à analyser par la détection de fluorescence

Question 9

Comment extrait-on les cellules de la rate et du thymus à partir des tissus homogénéisés?

Answer 9

Cellules extraites par tamisage

Question 10

Que fait-on avec les cellules avant de les analyser pour optimiser l’analyse au cytomètre de flux?

Answer 10

Dénombrer les cellules et ajuster leur concentration

Question 11

Comment évalue-t-on la concentration de cellules extraites du thymus?

Answer 11

Grâce au protocole de décompte cellulaire

Question 12

Quels marquages sont nécessaires pour la calibration du cytomètre de flux?

Answer 12

Marquages simples : Ac anti-CD4, Ac anti-CD8 et Ac anti-B220

Question 13

Si on veut attendre plus que 24h avant l’analyse des cellules passées au tamis, qu’est-il recommandé de faire?

Answer 13

Fixer les cellules en les incubant dans une solution de paraformaldéhyde 4% avant de les suspendre dans le tampon FB

Question 14

Quelle est la méthode habituelle pour la détermination du nombre de cellules en suspension?

Answer 14

Décompte avec l’hématimètre

Question 15

Comment fonctionne l’hématimètre?

Answer 15

Hématimètre rempli d’une suspension cellulaire par capillarité. Coloration avec Trypan bleu : permet de mesurer la viabilité des cellules d’une suspension (cellules mortes deviennent bleues), visualiser plus facilement toutes les cellules

Question 16

Quel est le modèle d’hématimètre le plus couramment utilisé?

Answer 16

AO-Spencer Bright-Line avec la chambre Neubauer modifiée

Question 17

Combien de chambres principales contient l’hématimètre, combien de carrés de quelle dimension possèdent les chambres et quelle est la profondeur des carrés?

Answer 17

2 chambres principales

9 grands carrés de 1 mm2 de surface par 0,1 mm de profondeur

Question 18

Combien de ml de la suspension contient chaque grand carré?

Answer 18

1 * 10^-4 ml (donc nb de cellules dans un grand carré = nb de cellules dans 1 * 10^-4 ml –> si on multiplie par 10^4, ça donne le nb de cellules dans 1 ml*** tenir en compte le facteur de dilution résultant du mélange de cellules avec le colorant)

Question 19

Quelle est l’équation générale qui permet de déterminer le nombre de cellules par ml avec la méthode de l’hématimètre?

Answer 19

Cellules / ml = Nombre de cellules comptées (16 petits carrés) * 10^4 *facteur de dilution

Question 20

Entre combien et combien de cellules doit-on avoir dans notre suspension cellulaire pour que l’erreur statistique soit acceptable?

Answer 20

Entre 100 et 500

Question 21

À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 100 cellules?

Answer 21

10%

Question 22

À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 500 cellules?

Answer 22

5%

Question 23

Combien de chiffres significatifs est-il justifié d’utiliser pour l’estimation de la viabilité avec un colorant comme le Trypan bleu?

Answer 23

2 chiffres significatifs et moins

Question 24

Entre quel et quel pourcentage de viabilité peut-on espérer d’obtenir?

Answer 24

Entre 60 et 90%

Question 25

Quelles sont les 3 sources d’erreurs principales possibles lors du décompte cellulaire à l’aide d’un hématimètre?

Answer 25

Remplissage inadéquat des cellules dans les chambres de l’hématimètre
Suspension cellulaire non homogène
Faible reproductivité

Question 26

Comment peut-on s’assurer d’éviter d’avoir un remplissage inadéquat des cellules dans les chambres de l’hématimètre?

Answer 26

Remplir les chambres par action capillaire en un seul mouvement, sans surcharge
Éviter les bulles d’air
S’assurer que la pipette et l’hématimètre sont propres
Chambres nettoyées après chaque usage
Hématimètre doit être nettoyé à nouveau si la suspension ne se distribue pas rapidement et uniformément

Question 27

Comment doit-on nettoyer l’hématimètre?

Answer 27

Avec de l’eau, puis avec de l’alcool 70%

Question 28

Quel pourcentage de cellules que nous observons doivent être libres de tout contact cellulaire?

Answer 28

Plus de 90%

Question 29

Que peut-on faire pour éviter d’avoir une suspension cellulaire non homogène?

Answer 29

Suspendre adéquatement l’échantillon

Réduire l’agrégation en préparant le suspension avec une solution saline dans Ca2+ si Mg2+, ou de l’acide citrique

Question 30

Comment régler un problème de faible reproductibilité?

Answer 30

Adopter un système de convention personnel pour le décompte cellulaire
Standardiser la suspension, la concentration et le type de colorant ainsi que le temps de contact après l’addition du colorant

Question 31

Combien de temps devrait durer le temps de contact après l’addition du colorant? Quel est le temps maximal?

Answer 31

Entre 5 et 10 min

Temps maximal : 15 min

Question 32

Pourquoi ne faut-il pas trop remplir la chambre ou ne pas la remplir suffisamment?

Answer 32

Car cela entraîne un décompte cellulaire inexact puisque le volume effectif dans les carrés n’est pas le volume attendu