Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
proteomics
Het bestuderen van eiwitten. De hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA omdat er nog allemaal regulatie volgt na de productie van mRNA.
steeds beter kunnen eiwit-identificatie, eiwitmodificaties en eiwit interacties bestudeerd worden
functies massa-spectrometrie
wordt gebruikt voor 3 dingen:
- (bindende) eiwitten identificeren
- kwantificeren (iets moeilijker, want piek zegt iets over relatieve hoeveelheid)
- eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering etc.)
werking massa-spectrometrie
Je begint met mengsel eiwitten, hier wordt trypsine (protease) aan toegevoegd. Trypsine knipt op de plek van een arginine (R) of lysine (K), daardoor beginnen kleine fragmenten allemaal met R of K. Eiwitten worden met laser beschoten en worden daardoor positief geladen. Door + lading bewegen eiwitstukjes met een bepaalde snelheid naar de negatieve pool. De snelheid is rechtevenredig met de grootte van het eiwit. Hoe kleiner de peptide, hoe sneller.
detector meet de tijden.
in grafiek representeert iedere piek een molecuulmassa en een relatieve hoeveelheid.
door de massa kan je in de computer zien uit welke aminozuren het eiwit bestaat en welk eiwit het dus is.
bindende eiwitten identificeren
Als je wil weten welke eiwitten binden met het eiwit dat je wil onderzoeken kan je ook massaspectrometrie gebruiken
Je weet de massa van het te onderzoeken eiwit, als je dan die massa van de grote pieken afhaalt, dan heb je de massa van het bindende eiwit
massa bindende eiwit= massa grote piek - massa onderzocht eiwit
eiwitmodificaties identificeren
eiwitmodificties zijn bijvoorbeeld methyl of fosfaatgroepen.
eiwitmengsel wordt behandelt met trypsine. Daarna worden fosfopeptiden toegevoegd.
Dan massaspectrometrie. Je weet de massa van een fosfaatgroep. Dus als je nu weer naar de moleculaire massa’s kijkt, kan je zien welke peptiden gefosforyleerd zijn.
metabolomics
Analyseert welke metabolieten voorkomen in bijvoorbeeld het bloed.
hierbij wordt weer massaspectrometrie gebruikt.
stappen:
- sample preperation (evt zuivering)
- massaspectrometrie
- identificatie met behulp van computer
- herkennen van patroon
- wat is de biomarker?
dit kan worden gebruikt bij het vroeg opsporen van tumoren. Want 1 vd hallmarks of cancer= deregulering van energievoorziening. Een tumor maakt hiermee metabolieten die normaal niet in zulke grote hoeveelheden gemaakt worden.
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwitactivtiteit?
Na het maken van mRNA gebeurt er nog heel veel voordat het een eiwit wordt.
Je hebt nog:
-regulatie van eiwitmodificaties
-regulatie van eiwitstabiliteit (afbraak door proteases)
-regulatie van translatie (aantal eiwitten dat van mRNA molecuul gemaakt wordt)
regulatie van translatie
MiRNA (20-25 nucleotide lang) ligt op het DNA en heeft een regulerende functie voor het transleren van mRNA.
Dit gaat in de volgende stappen:
-Van het DNA wordt miRNA afgeschreven
-Drosha (enzym complex) knipt het tot pre-miRNA (in celkern)
-Dicer knipt het tot miRNA (klein stukje dubbelstrengs RNA) (in cytoplasma)
-1 streng wordt ingebouwd in het RISC complex. RISC bindt aan de complementaire sequentie mRNA
-miRNA zorgt voor specificiteit.
eiwitcomponenten kunnen voor repressie van translatie zorgen of voor meer mRNA afbraak
Als RISC complex aan mRNA dus is gebonden kan er geen translatie plaatsvinden
microRNA en kanker (miR-16)
Is heel belangrijk, bijna de helft van het onderzoek naar microRNA heeft te maken met kanker.
Een voorbeeld van een directe invloed van microRNA op genen betrokken bij kanker:
MiR-16 komt verlaagd tot expressie in een aantal tumoren
hierdoor zijn Bcl2 en CDC25A beide verhoogd
Bck2–> apoptose remming
CDC25A–> celcyclus progressie
onderzoek naar microRNA
met behulp van microarrays kan de expressie van 100den miRNA’s tegelijk worden bepaald. NGS kan ook worden gebruikt
dit geeft goede diagnostische en prognostische info
combinatie met mRNA microarrays/sequencing, proteomics en metabolomics geeft zeer veel informatie
alle technieken duur, dus uiteindelijk zal voor een relatief goedkope combinatie gekozen worden, nog niet duidelijk welke dat zal worden
ingrijpen in groei van kankercellen met kinase activiteit remmer imatinib
Bij CML speelt het eiwitproduct van het Philadelphia chromosoom een rol bij de ziekte
Het remmen van de kinase activiteit van BCR-Abl met Imatinib wordt nu gebruikt als behandeling
Nadelen:
- Specificiteit van dergelijke remmers is vaak een probleem
- Er kan gemakkelijk resistentie ontstaan
- Het zal vaak niet lukken om een geschikte remmer te vinden
ingrijpen in groei van kankercellen met siRNA’s
siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (dit wordt ook wel ‘RNA interferentie’ genoemd)
zonder mRNA–> geen eiwit
RNA interferentie (RNAi) kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen
Voordelen van RNAi:
- Heel eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waar je de sequentie van weet
- Zeer specifiek
- Door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
- Zeer geschikt voor hoge doorvoer analyses (RNAi libraries)
Nadelen van RNAi:
- Kan in principe alleen gebruikt worden om expressie te remmen
- We weten nog niet hoe we het siRNA in de gewenste cellen moeten inbrengen (daarom grote kans dat dit in kliniek gebruiken lastig wordt)
