2-Chromatographie

Question 1

les propriétés communément utilisées pour effectuer le fractionnement sont

Answer 1

• les interactions ioniques (Chromatographie par échange d’ions)
• la taille (Chromatographie par gel-filtration)
• la spécificité (Chromatographie d’affinité)

Question 2

un échangeur de cations…

Answer 2

porte des groupes chargés négativement (R-) et lierait

des cations de manière réversible

Question 3

l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de

Answer 3

• du pH de la solution

- de la nature et des concentrations des autres ions en solution

Question 4

les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de deux
caractéristiques importantes:

Answer 4

• La nature de leur matrice.
• Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser
  l’attachement de la protéine

Question 5

les matrices utilisées en chromatographie sont…

Answer 5

des polymères insolubles

préparés sous formes de billes, appelées familièrement résines

Question 6

les polymères le plus souvent utilisés sont…

Answer 6

des polysaccharides comme le cellulose

ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères

Question 7

échangeur fort…

Answer 7

reste

pleinement chargé entre pH ~ 3 et ~ 10

Question 8

QAE

Answer 8

amine quaternaire - (N+ pKa ~ 9.5) à échangeur anionique fort

Question 9

sulfonates

Answer 9

échangeur cationique fort.

Question 10

DEAE

Answer 10

amine tertiaire - partiellement chargé à partir de pH 7 à 8 à
échangeur anionique faible.

Question 11

CM

Answer 11

carboxyméthyle - pleinement chargé à partir de pH 4.5 à échangeur
cationique faible.

Question 12

protéines se lient aux échangeurs par…

Answer 12

des forces électrostatiques

Question 13

plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration est…

Answer 13

lente

Question 14

procédé d’élution fractionnée

Answer 14

un tampon de

concentration saline supérieure au tampon de lavage

Question 15

procédé d’élution par gradient

Answer 15

les gradients de sels sont le moyen le plus souvent utilisés afin d’éluer les
protéines adsorbées sur l’échangeur

Question 16

Sels utilisés pour former des gradients

Answer 16

KCL et NACL

Question 17

chromatographie par gel-filtration sépare les molécule par…

Answer 17

taille et forme

Question 18

Les principes de cette méthode: (3)

Answer 18

1- phase stationnaire (résine) xonsiste en un résau de polymères réticulé possédant des pores
2- pores dans les billes du gel laisse rentrer des petites molécules (limite d’exclusion)
3- protéines qui pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus vite

Question 19

matrices sont faites à partir de quoi…

Answer 19

polymères insolubles à base de polysaccharides comme:

le dextrane, l’agarose ou le polyacrylamide

Question 20

la porosité des gels dépend de…

Answer 20

la masse moléculaire du polymère
et
nombre de liaisons entre molécules du polymères

Question 21

qu’est ce que le volume d’élution?

Answer 21

volume de solvant nécéssaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne

Question 22

Volume total de la colonne= ?

Answer 22

Vt= Vx + Vo
Vx: Volume occupé par les billes
Vo: Volume mort

Question 23

membranes (saran wrap) utilisés pour la dialyse sont fait de…

Answer 23

cellophane (cellulose)

Question 24

sous divisons de filtration moléculaire…

Answer 24

filtration moléculaire—-> dialyse—–> centrifugation sur colonne filtre

Question 25

chromatographie d’affinité

Answer 25

ligand qui lie avec protéine d’intérêt

Question 26

comment récupérer la protéine dans une chromatographie d’affinité?

Answer 26

• ajout d’excès de ligand libre
• changer pH
• changer force ionique et,ou la température

Question 27

Kd de l’interation ligand-matrice doit varier entre…

Answer 27

10-4 M et 10-10M et ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand

Question 28

quantité de protéine retenue dépand de (3)…

Answer 28

• du KD’ ( trop faible si plus grand que 10-4M)
• concentration de protéine dans l’extrait
• degré de liaison du ligand à la matrice

Question 29

matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être … (3)

Answer 29

• chimiquement inerte
• avoir uhe grande porosité
• présenter de nombreux groupements fonctionnels

Question 30

liaison entre matrice d’agarose et ligand se fait en deux temps…

Answer 30

1. réaction de l’agarose avec du bromure du cyanogène, qui produit un intermédiaire activé et stable
2. ligand réagit avec le l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence

Question 31

Détection des protéines lors de l’élution d’une colonne chromatographique

Answer 31

1) absorption des protéines dans l’UV
2) essai colorimétrique
3) essai enzymatique
4) détection de la protéine sur gel SDS-Page
5) détection avec anti-corps