Les cellules mésenchymateuses pulmonaires et leur rôle dans la fibrogénèse Flashcards
Physiopathologie de la fibrose :
Maladie épithéliale qui se caractérise par accumulation de matrice extracellulaire et de fibroblastes dans le poumon distal entrainant une destruction alvéolaire.
Agressions chroniques de l’épithélium respiratoire distale au cours des années, avec une activation anormale des pneumocytes de type II qui vont alors recruter des cellules mésenchymateuses et des fibroblastes, sécréteurs de matrice extracellulaire, ce qui va aboutir au remodelage pulmonaire à l’origine de la fibrose pulmonaire.
Au plan histologique :
Prédominance des lésions dans quelles zones ?
Comment s’appellent les zones actives ?
Hétérogénéité spatiale et temporelle du parenchyme avec des zones de fibrose de stades différents qui jouxtent un parenchyme sain. Les lésions les plus sévères sont distribuées essentiellement dans le parenchyme basal sous-pleural.
On note ces foyers fibroblastiques (fibroblast foci) qui sont considérés comme les zones « actives » de la maladie.
Quels sont les marqueurs des fibroblastes ?
Que se passe-t-il si l’on transfère des fibroblastes de fibrose chez une sours ID ?
Ce fibroblaste n’a pas de marqueur spécifique, il est défini par défaut : d’origine non immune, non épithéliale, non endothéliale
Expérience : ils ont pris des fibroblastes humains contrôles et des fibroblastes de patient FPI. Ils ont ensuite fait un transfert adoptif intraveineux (= consiste à transférer des cellules dans un hôte, afin de faire bénéficier ce dernier de leurs fonctions immunitaires) dans des cellules SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency, donc sans défense immunitaire). Lors du transfert avec des fibroblastes contrôles (A), pas de fibrose observée chez la souris. Par contre lors du transfert de fibroblastes humains de FPI (C), apparition d’une fibrose pulmonaire. Ce qui veut dire que les cellules mésenchymateuses sont suffisantes pour induire une fibrose pulmonaire.
Les cellules mésenchymateuses représentent quel % des cellules de l’alvéole ?
Comment sont définies les cellules interstitielles du poumon normal ?
Quelles sont les cellules mésenchymateuses ? (4)
Représentent 20% des cellules présentes dans les alvéoles
Les cellules interstitielles du poumon normal : définit selon leur morphologie et leur position
Fibroblastes : myofibroblates alvéolaires, Lipofibroblastes
Péricytes
Cellules mésothéliales
Cellules souches mésenchymateuses
Fibroblate:
Quels sont ses rôles ? (2)
Comment les reconnait-on ? (3)
Population hétérogène de cellules, non hématopoïétiques dîtes « de structure »:
- Homéostasie et support des cellules qui porte la fonction de l’organe : maintien de l’intégrité de l’épithélium
- Sécrétion et renouvellement de la MEC
Sur le plan morphologique elle n’exprime par de marqueurs particuliers, c’est donc un faisceau d’argument qui va permettre de l’identifier :
- Cellules fusiformes, aplaties, parfois étoilé.
- Cytoplasme : contient de réticulum endoplasmique et des ribosomes visibles en microscopie électronique. Elles contiennent des protéines non spécifiques du cytosquelettes : vimentine (présentes aussi dans les macrophages), desmine.
- Exprime un récepteur pour le PDGF : PDGF receptor alpha
Sécrétion de la MEC :
Que sécrète le fibroblaste ?
Quelle expérience pour le mettre en évidence ?
1ère grande fonction du fibroblastes est la production de collagène (marqué Col1)
Modèle de souris transgénique : Ils ont pris le promoteur du collagène 1 et ont collé une protéine fluorescente verte (abrégé GFP, dérivé d’une méduse). Ils ont inséré dans le génome de la souris. La cellule va devenir verte quand promoteur de la cellule est activé pour permettre de la repérer. On voit plein de cellules vertes qui expriment de Col1. Elles expriment PGFR A et non PGFR B (exprimé par les fibrocytes). Donc dans un poumon sain, les cellules qui expriment du collagène se sont essentiellement des fibroblastes.
Quelle est la méthode du transcriptome par microarray ?
(→Mesure du niveau d’expression moyen de chaque gène dans une population de cellules.)
Concrètement, les ARN totaux sont extraits de cellules puis subissent une amplification qui permet d’obtenir une quantité de matériel génétique suffisante pour l’expérience.
- Ensuite, ces ARNm (fragile +++) sont transformés en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de rétrotranscription et marqués par un colorant [soit la cyanine 3 (fluorochrome vert) soit la cyanine 5 (fluorochrome rouge)].
- On met ensuite les ADNc obtenus dans une puce contenant des fragments d’ADN (=sondes de séquence d’ADN connus), en même temps que l’ADNc étalon (normals cells). Il se passe une réaction d’hybridation = propriété que possède l’ADN dénaturé de reformer spontanément sa double hélice lorsqu’il est porté face à un brin complémentaire.
- Chaque point (ou spot, dot) de la puce est analysé individuellement par un scanner à très haute résolution. L’intensité du signal est proportionnelle à la quantité d’ADN présent. La couleur donne l’origine de l’échantillon. Chacune des valeurs peut être analysée par des techniques de bio-informatique, ce qui permet d’estimer avec plus ou moins de précision l’intensité d’expression d’un gène. En général 1 colonne = 1 échantillon. Code couleur rouge/vert
Les fibroblastes pulmonaires ont-ils le même transcriptome que les cellules mésenchymateuses d’autres organes ?
Les cellules mésenchymateuses pulmonaires ont un répertoire transcriptomique spécifique.
Limite : ne permet qu’une vision globale, mais ne permet pas de distinguer les cellules entre elles (hétérogénéité cellulaire masquée).
Quel est le principe du Single cell RNA sequencing : séquençage cellule unique (2015) ?
(Mesure de l’expression des gènes dans chaque cellule de l’échantillon (étude des différences transcriptomiques et de l’hétérogénéité cellulaire).
1- Isolement des cellules en microfluidique (permet la manipulation des fluides dans des microcanaux) : Grâce à cette technique, on va pouvoir isoler chaque cellule dans une gouttelette d’huile contenant des enzymes et une bille particulière appelée GEM (Gel bead in EMulsion).
2- Chaque GEM est recouverte de séquences adaptatrices uniques contenant
o un barcode (identifiant unique de la cellule) d’origine
o un UMI (Unique Molecular Identifiers : courte séquence aléatoire unique à chaque fragment entourant la bille)
o une séquence PolyT qui va permettre la fixation des ARNs messagers par complémentarité avec leurs queues poly A.
3- La réaction de séquençage de l’ARN peut alors se faire dans ce microréacteur. Après lyse de la cellule, les ARNm sont capturés à la surface de la GEM par leurs queues polyA. Et les nouvelles séquences Barcode+UMI+ARNm sont converties en ADNc.
4- Création d’une libraire pour le séquençage : tous les fragments d’ADNc sont identifiés par leur barcode et classés.
5- Représentation graphique à l’aide d’un logiciel informatique : Chaque point correspond à une cellule. Plus les cellules sont proches sur le graphique, plus leurs expressions génétiques sont similaires.
Quels sont les limites du single cell ?
- Digestion du tissu : manipulation difficile à obtenir. Les cellules peuvent mourir durant digestion.
- On obtient que les ARNm majoritaire.
- On perd l’information de position
- On peut passer un nombre limité de cellules, les macrophages et cellules épithéliales sont les cellules prépondérantes, il vaut mieux les extraire si on veut étudier les cellules stromales.
-
Coûte très cher
➢ Si un gène d’intérêt n’apparaît pas sur le graphique c’est peut-être que la digestion a tué la cellule ou qu’il n’était que très peu exprimé.
Les fibroblates du poumon sont-ils uniques ?
- Non : différents transcriptomes au sein des fibroblastes du poumon
Microarray et séquençage en cellule unique permettent-elles une carte spatiale ?
Quelles techinques utiliser ? (3)
- Le microarray et le séquençage en cellule unique sont destructives et ne permettent pas de reconstituer une carte spatiale de l’expression des gènes.
- Lorsque l’on souhaite regarder où un gène est exprimé dans un organe, plusieurs techniques existent : l’hybridation in situ et ses dérivés qui vont reconnaître l’ARN du ou des gènes recherchés, ou l’immunohistochimie. Mais : rarement plus de 3 gènes en même temps
- La transcriptomique spatiale est une technique hybride, mêlant histologie, microarray, et techniques de capture d’ARN utilisées en single-cell RNA-seq. Technique non détaillée (voir Travaglani et al Nature 2020). Coût faramineux +++
2ème fonction du fibroblate : fonction de niche (soutien de la cellule épithéliale)
2 expériences in vitro le montre ?
- Fibroblaste => survie de la cellule épithéliale via : interaction intercellulaire directes, facteurs solubles, ECM, facteurs physiques (pO2, facteurs mécaniques).
Les expériences montrent :
- In vitro qu’il y a une co-localisation pneumocytes II et fibroblastes.
- In vitro que les P2 prolifèrent qu’en présence de cellules PDGFR-A + soit par contact direct soit par sécrétion de FGF7.
On parle aussi d’unité trophique épithélium-mésenchymateuse.
Exemple de différence fonctionnelle de fibroblastes péribronchiques vs alvéolaires profonds (transcriptome différents) :
Ajout de cellules Club (cellules souches) avec :
Cellules mésenchymateuses proximales
- LGR6+ / Synthèse FGF10
=> Différenciation bronchiolaire directes des cellules épithéliales
Cellules mésenchymateuses distales
- LGR5+ / Synthèse Wnt
=> Différenciation directe des PII
Lipofibroblates :
Aurait quel rôle ?
Quels marqueurs ?
- Espèce rare (et discuté) chez l’homme mais pas chez la souris.
- Sous population de fibroblastes alvéolaire
- Possède des vacuoles lipidiques sans membrane
- Aurait un rôle dans la biosynthèse du surfactant.
- Synthèse : leptine, rétinol
- Dérive des FGF10 + progéniteurs au cours du
développement - Marqueurs : ADRP (= Perilipin 2), lipides neutres (Sudan Black et Oil Red O, mais attention ADRP exprimé aussi par les macrophages et les adipocytes).
