Biochemie - 9. Metody laboratorních vyšetření

Question 1

1. Chromatografické metody

Answer 1

Chromatografie

• fyzikálně-chemické separační metody založené na rozdělování složek směsi vzorku mezi 2 fáze - stacionární a mobilní
• tyto 2 fáze se od sebe odlišují např. polaritou
• dělené složky vzorku interagují v různé míře s oběma fázemi

Question 2

2. Elektrochemické metody - elektroforéza, elektrochemické analytické metody

Answer 2

Elektroforéza
- soubor separačních metod využívající k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli
- na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly
Elektrochemické analytické metody:
- POTENCIOMETRIE
- AMPEROMETRIE
- POLAROGRAFIE
- COULOMETRIE

Question 3

2. Elektrochemické metody - POTENCIOMETRIE

Answer 3

• Severinghausova el. pCO2

- Iontově selektivní metoda

Question 4

2. Elektrochemické metody - AMPEROMETRIE

Answer 4

• Clarkova el. pO2
• Glukometry - H2O2
• Alkoholtestery - NADH

Question 5

2. Elektrochemické metody - POLAROGRAFIE

Answer 5

• Jaroslav Heyorvský - 1959

Question 6

2. Elektrochemické metody - COULOMETRIE

Answer 6

• analyt je stanoven z velikostí náboje prošlého vzorku na základě Faradayova zákona

Question 7

3. Optické metody

Answer 7

• Spektrální metody
• Metody emisní
• Metody absorpční

Question 8

3. Optické metody - Metody spektrální

Answer 8

• založené na výměně E mezi látkou a zářením
• spektrum je závislost veličiny, která je mírou intenzity záření vysílaného nebo prošlého vzorkem na vlnové délce záření

Question 9

3. Optické metody - Metody emisní

Answer 9

• měření záření vysílaného vzorkem

Question 10

3. Optické metody - Metody absorpční

Answer 10

• sledují pohlcování záření vzorkem
• UV-Vis spektrometrie
• IR spektrometrie

Question 11

3. Optické metody - Atomová vs. molekulová spektra

Answer 11

• atomy a molekuly mění svůj energetický stav přijmutím/vyzářením pouze určitých hodnot energie
• atomy přijímají/vyzařují pouze elektrony
• v molekulách jsou energetické hladiny rozštěpeny na podhladiny rotační a vibrační
• 1 z nejrozšířenějších metod stanovení látek v roztocích
• stanovení org. látek, anorg. látek
• kvalitativní i kvantitativní analýza

Question 12

Nespektrální metody - definice, typy (4)

Answer 12

= nesledujeme výměnu energie mezi látkou a zářením, ale sledujeme změny některých vlastností, např. rozptyl záření, změny rychlosti záření

1. REFRAKTOMETRIE
2. POLARIMETRIE
3. NEFELOMETRIE
4. TURBIDOMETRIE

Question 13

Nespektrální metody - 1. refraktometrie

Answer 13

• měření lomu záření - změna směru šíření světelné vlny na rozhraní 2 optických prostředí

Question 14

Nespektrální metody - 2. polarimetrie

Answer 14

• měření změny stáčení roviny polarizovaného světla

- cirkulární dichroismus: rozdíl molárních absorpčních koeficientů pro pravo- a levotočivé polarizované světlo

Question 15

Nespektrální metody - 3. nefelometrie a 4. turbidometrie

Answer 15

= rozptylové metody

• Tyndalův jev -> difúzní rozptyl - platí pro částice o velikosti menší než 1/10 vlnové délky dopadajícího záření
• využití: precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou -> IMUNOCHEMIE

Question 16

Imunochemické metody

Answer 16

• proteiny, protilátky a hapteny (antigeny, drogy, steroidy)
• Interakce antigen (hapten) - protilátka
• > vazebná síla, antigenní determinanta, afinita, avidita, křížová reakce, precipitace, protilátka monoklonální a polyklonální
• v roztoku, v gelu

Question 17

Imunochemické metody - imunoprecipitační metody

Answer 17

• tvorba precipitátu - ekvivalence

- malé neprecipitační imunokomplexy

Question 18

Imunochemické metody - Metody se značenými molekulami

Answer 18

• enzym -> EIA, ELISA
• radioaktivní značení -> RIA
• fluorescenční značení -> FIA, DELFIA
• chemoluminiscence (enzym a zesilující systémy)
• koloidní zlato
• samé výhody (rychlosti, citlivost,…) vs. cena a monopol farmaceutických firem

Question 19

Imunochemické metody - nekompetetivní a kompetetivní

Answer 19

Nekommpetetivní
- těhotenský test
- tvorba ,,sandwich'' komplexu
Kompetetivní 
- test na drogy
- kompetice mezi drogou vázanou výrobcem a ve vzorku o IgG

Question 20

Molekulárně-biologické metody

Answer 20

• analýza NK
• DNA - geny vlastní, patogeny = viry, bakterie
• RNA - patogeny (viry) -> reverzní transkriptáza

Question 21

Molekulárně-biologické metody - Polymerázová řetězová reakce PCR + Kvantitativní polymerázová řetězová reakce qPCR

Answer 21

PCR
- Taq DNA polymeráza
qPCR
- forward primer/gPCR probe/reverse primer

Question 22

Molekulárně-biologické metody - Isotermální amplifikace využívající smyček LAMP

Answer 22

• Bst DNA polymeráza

- 5 LAMP primerů: F3, F1cF2, B1cB2, BL, B3c

Question 23

PCR vs LAMP

Answer 23

PCR
- teplotní cykly (drahý přístroj)
- 2 ,,primery’’ - specifické oblasti DNA
- POMALÉ, typicky > 1 hodina
- výtěžek amplifikace - 0,2 mg
- nevhodné pro vizuální detekci (drahý přístroj pro detekci a náklady na další činidla)
- citlivé k přítomnosti inhibitorů Taq DNA polymerázy
LAMP
- Izotermální - jediná teplota (bez přístroje)
- 4-6 primerů - SPECIFICKÉ
- RYCHLÉ, typicky <30 minut
- výtěžek amplifikace - 10-20 mg (100x vice než PCR) - CITLIVÉ
- vhodné pro vizuální detekci (bez přístroje) - zákal, barva… - LEVNÉ
- vysoká tolerance k inhibitorům Bst DNA polymerázy

Question 24

Metody detekce infekce RNA virem SARS-CoV2 - detekce viru, detekce protilátek, imunochemický princip detekce

Answer 24

Detekce viru:
- RT-qPCR - RNA -> DNA
- LAMP - RNA -> DNA
- Antigenní testy - antigenní proteiny z povrchu viru, imunochemický princip
Detekce protilátek:
- testuje se odezva organismu na virovou infekci produkcí protilátek
- Imunochemický princip detekce
-> IgM-IGA - během nemoci
-> IgG - po prodělání infekce
- detekce proteinu SARS-CoV2 spike/S1 RBD pomocí nekompetetivního testu -> tvorba ,,sandwich komplexu’’ - stejně jako těhotenský test