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biologia KARP 8va > CAP 18 > Flashcards

CAP 18 Flashcards

1
Q

Microscopios Ópticos

A

Dispositivos diseñados para observar estructuras que debido a su pequeño tamaño son invisibles al ojo humano

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2
Q

Estructura del MO de Campo brillante (común o convencional)

A
  • Fuente de luz
  • Espejo: refleja la luz
  • Lente condensadora: concentra la luz hacia la muestra
  • Espécimen: Muestra en estudio
  • Lente objetivo: agranda la imagen
  • Lente ocular: agranda más la imagen
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3
Q

Poder de Ampliación del MO

A
  • Cap. del MO de dar imágenes grandes
  • Depende del poder de:

Lente objetivo: hasta 100X
Lente ocular: 5X, 10X, 15X

Poder de ampliación útil máximo: 1500K
más allá de este poder es “Amplificación Vacía”

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4
Q

Poder de Resolución del MO

A
  • Cap. del MO de dar imágenes nítidas
  • Se mide inversamente calculando el “Límite de Resolución” (d) es la mínima distancia entre 2 puntos para discriminarlos como tales

A menor límite = Mayor poder de resolución

   Cte. d= (0,61x long. de onda) / NA (apertura numérica)
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5
Q

MO de campo brillante sirve para ver

A

d promedio = 0,2 Mm (200nm)

  • Tejidos
  • Células
  • Cromosomas
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6
Q

Visibilidad de la muestra

A
  • Para MO de campo brillante necesitamos usar una sección de muestra tan delgada que es invisible y debe sufrir preparación:

1) Obtención: Muestra de 1cm3

2) Fijación: Se sumerje en formaldehído, alcohol o ác. acético (para conservarse). Esto MATA a la célula.

3) Deshidratación: Elimina H2O con alcohol

4) Inclusión: Agregado de parafina para endurecer

5) Corte: con un micrótomo para obtener láminas delgadas (5 Mm)

6) Aclaramiento: con benceno o tolueno

7) Tinción: con colorantes

8) Montura: la muestra se coloca entre 2 láminas de vidrio
- Arriba: Cubreobjeto
- Abajo: Portaobjeto

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7
Q

MO de Interferencia

A
  • Posee lentes y prismas adicionales que permiten aprovechar el fenómeno de interferencia de ondas luminosas que permite generar brillos y contrastes sin necesitar tinción ni preparación alguna
  • Sirven para estudiar células vivas
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8
Q

Tipos de MO de Interferencia

A
  • MO de contraste de fases
  • MO de Nomaski ( de interferencia diferencial o DIC )
  • MO de interferencia con video y procesamiento de imagen
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9
Q

Microscopía de Fluorescencia

A
  • Se utiliza el fenómeno de absorción de luz que presentan ciertos pigmentos para luego reflejar una luz de menor energía
  • Poseen gran sensibilidad ( Detecta aun en bajas [ ] )
  • Los figmentos con esta cap. se denominan fluorocromos o fluoróforos
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10
Q

Microscopía de Fluorescencia se emplea para

A
  • Estudiar células vivas
  • Se pueden marcar Prot. y ver su movimiento o detectar su presencia/localización
    Para marcar Prot. — Anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes
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11
Q

Tipos de Fluorocromos

A
  • Sintéticos: Rodamina y Fluorestina

Estos pigmentos pueden asociarse con anticuerpos a modo de aumentar su especifidad
Generalmente las prot. con anticuerpos pierden funcionalidad

  • Naturales:

Medusa
* Aequorina
* GFP (Prot. verde fluorescente):
YFP — Amarilla
BFP — Azul
CFP — Cian

Anemona
* Ds Red
mOrange
mBanana
mTangerine

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12
Q

GFP

A
  • Presenta una variante conocida como mCit
  • La fluorescencia de la GFP se debe a un proceso autocatalítico en 3 de sus residuos (monomerica beta laminar)
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13
Q

Ds Red

A
  • Prot. cuaternaria formada por 4 subunidades
  • Sus variantes son Prot. monoméricas (No afectan la funcionalidad de las Prot.)
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14
Q

FRET (Transferencia de energía por resonancia de fluorescecia)

A
  • Permite el estudio de cambios conformacionales en Prot. por medio de la detección de cambios en la luz emitida por la muestra
  • Cuando la distancia entre 2 o más fluoroforos de 1 a 10 nm pueden transferir energía
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15
Q

Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)

A

Utiliza un haz de -e y un sistema de lentes (bobinas) electromagnéticas

Estructura
- Pistola o Cañón: Filamento de Tungsteno (Cátodo)
- Ánodo: con carga +
- Bobina condensadora
- Bobina Objetivo: muestra ahí
- Bobina proyectora
- Pantalla Fluorescente: transitoria
- Placa MIcrográfica: Permanente

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16
Q

Características

A

1) Poder de magnificación:
Objetivo: 100X
Proyectora: 200X
Total: 20 000X

2) Poder de Resolución: Depende de la long de onda del haz de -e que se calcula
long. de onda de -e = raíz de 150 / Voltaje

Voltaje: entre 10 000 y 100 000 V (gral. 60 000V)

Limite de resolucion: dreal = 10 a 15 °A
dpráctico = 3 °A (0,3nm)

3) Visibilidad: los -e atraviesan la muestra como si no existiera, por lo que la muestra es invisible y requiere preparación

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17
Q

Preparación de TEM

A

1) Obtención: Muestra de 1mm3

2) Fijación: *Glutaraldehído: Prot.
*Tetróxido de Osmio: Lípidos

3) Deshidratación: Elimina con etanol al 70, 95 y 100%

4) Inclusión: Se endurece la muestra con Polimerzación de Resinas Epóxicas o Acrílicas

5) Corte: con un micrótomo con cuchilla de vidrio o diamante

6) Aclaramiento: con Oxido de Propileno

7) Tinción y Montura: se tiñe o contrasta con metales pesados: Acetato de Uranilo y Citrato de Plomo

Los núcleos de los átomos pesados impiden el avance de los -e y así forman la imagen

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18
Q

Magnificación Vacía

A
  • Si el poder de magnificación sobrepasa al poder de resolución:
  • Imagen enorme
  • No se distingue buen
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19
Q

Criofijación

A

Los fijadores se pueden desnaturalizar y precipitar prot y generar imágenes defectuosas llamadas “Artefactos”, por eso se utiliza este método que consiste en la congelación rápida en N líquido, He líquido, Propano líquido

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20
Q

Ventajas de la criofijación

A
  • Más rápido
  • Reemplaza fijación e inclusión en 1 solo paso
  • Evita la formación de cristales de hielo
  • No mata a la célula (Hibernación) — Sirve para conservar esperma, cigotos, células madre, etc.
  • No desnaturaliza a las prot — ideal para conservar enzimas
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21
Q

Preparaciones especiales para TEM

A

1) Coloración especiales para TEM:
- P/ partículas como complejos multimoleculares o virus
- La muestra NO se “tiñe” con el contraste, por lo que colorea el entorno. Ej: Fosfotungstato

2) Modelo de sombra:
- También para partículas
- Se realiza un sombreado con Platino al vacío
- Da efecto 3D a la imagen

3) Criofractura (Congelación, Fractura, Replica)
- Es la mejor técnica para estudiar estructuras múltiples y complejos. Ej: MP

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22
Q

Pasos de Criofractura

A

1) Congelación: En N líquido a -170°

2) Fractura: Por “golpe de navaja” al vacío

3) Grabado: Sublimación al vacío en cámara fría a -40°C, donde se consigue resaltar los contornos

4) Evaporación:
*Rasante: Se agrega Platino en ángulo

*Vertical: Se deposita C sobre la muestra

Se genera un molde de C y Pt

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23
Q

Crioelectro tomografía (Crio - ET)

A
  • otra técnica para TEM
  • Se realiza una criofijacion sin corte ni fractura, luego de agregar los metales pesados, se elige una región delgada y se toman múltiples micrografias en distintos ángulos. Luego se hace una reconstrucción 3D de las imágenes tomadas
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24
Q

ME de Barrido (SEM)

A
  • Es un microscopio diseñado para obtener imágenes 3D de la superficie de la muestra (no de su interior)
  • Tiene gran profundidad de campo, por lo que puede observar nuestras gruesas, ej: insectos
  • El límite de resolución ronda los 20 nm
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25
Q

Tipos de radiación

A

Todos los NM presentan radiación Beta excepto el Iodo (beta y gamma)

-Rayos alfa: equivalenyes al núcleo del He

  • Rayos beta: equivalentes a 1ē
  • Rayos gamma: equivalentes a 1 fotón
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26
Q

Vida media (t/2)

A

El tiempo que le toma a una muestra radiactiva perder la mirada de su masa por desintegración

Medida de la inestabilidad de un radioisotopo

27
Q

Técnicas de Análisis

A
  • Inmunoterapia
  • Centellografía líquida
  • Autorradiografia
28
Q

Cultivo Celular

A

Método de obtención de muestras celulares

1) Cultivo Primario: las células se obtienen por extracción directa del tejido

2) Cultivo secundario: las células se obtienen de un cultivo previo

3) Cultivo de Línea: Utiliza células tumorales. Ej: HeLa

29
Q

División celular

A
  • Las células normales presentan un número limitado de divisiones posibles (50-100)
  • Las células en línea presentan divisiones indefinidas, mientras el ambiente sea favorable
30
Q

Fraccionamiento Celular

A

Método de separación o aislamiento de componentes que se vale de la fuerza centrífuga y de la densidad

  • Fraccionamiento por centrifugación diferencial
  • Fraccionamiento por Gradiente de densidad
31
Q

Fraccionamiento Proteico

A
  • Método de purificación o separación de Proteínas
  • Cristalografía de Rayos X: análisis de proteína solubles
  • Crio - EM y reconstrucción: Prot. Integrales
32
Q

Método de Purificación o separación de Proteínas

A

1) Precipitación selectiva: se utiliza solo para hacer variar la solubilidad de las Prot.

2) Cromatografía líquida en columna

3) Espectrometría de masa

33
Q

Trazador

A

Sustancia que revela presencia, se puede monitorear o localizar durante el curso de un experimento

Dependiendo de la Sust. Y tiempo. Puede estar marcado por:

Fluorescencia
Con giro
Con densidad
Radiactivamente

34
Q

Vida media ejemplos

A

Tritio: 12,3 años
11C: 20 minutos
14C: 5700 años
45Ca: 152 días

35
Q

Grupo marcado permite

A

Detectar una molécula sun afectar la especificidad de sus interacciones

36
Q

Espectrometría de Centelleo Líquido

A

Para medir cantidad de radiactividad en una muestra

37
Q

Autorradiografia

A
  • Para determinar donde se localiza un isótopo particular
  • Importante en los primeros descubrimientos sobre actividades sintéticas de la célula
  • Aprovecha la cap. De la célula para activar una emulsión fotográfica, como rayos X o la luz en un trozo de película
38
Q

Composición de meduos artificiales para el cultivo celular

A

Nutrientes, vitaminas, prot. Purificadas, insulina, factor de crecimiento epidérmico, transferrina

39
Q

Cultivos primarios en células animales

A

Embriones

40
Q

Disociación de tejidos

A

Con enzima proteolitica Tripsina

41
Q

Cultivo Bidimensional

A

Las células se siembran en superficie plana de una placa preparada

42
Q

Cultivo Tridimensional

A

Se cultivan en una matriz tridimensional de materiales extracelulares sintéticos o naturales

Más adecuados para estudiar interacciones entre células

Proporciona entorno más natural para células cultivadas

Se refleja en
- Dif.en la organización del citoesqueleto
- Tipos de diferencias celulares
- Actividades de señalización
- Estado de diferenciación

43
Q

Células vegetales cultivadas

A
  • Enzima celulasa digiere la pared ceular liberando la célula desnuda o Protoplasto

-Callos: Grupo de células indiferenciadas

44
Q

Centrifugación Diferencial

A
  • Aislamiento de un orgánulo particular en grandes cantidades
  • Más densos van al fondo
  • Peroxisomas, lisosomas, mitocondrias, cloroplastos
45
Q

Velocidades de la ultracentrifuga

A

75 000 rpm = 500 000 veces gravedad

46
Q

Cromatografía líquida en columna

A
  • Aislarla en estado puro (sin contaminantes)

Fases:
- Fase móvil: Disolvente en movimiento
- Fase inmóvil: la matriz

47
Q

Cromatografía de intercambio iónico

A

Depende de intercambio iónico depende de la unión de prot a un material inerte de la matriz

Resinas de Intercambio iónico
- Dietilaminoetil (DEAE) (+) Se une a moléculas (-)

  • Carboximetil Celulosa (CM) (-) molécula (+)
48
Q

Cromatografía de filtración en gel

A

Separa Proteínas o Ácidos Nucleicos en función a su tamaño efectivo en perlas de SEFADEX G-150 que se empaquetan en columna a través de la cual ma solución pasa

  • Materiales compuestos por polisacáridos reticulados de dif porosidad DEXTRANOS o AGAROSA
49
Q

Cromatografía de Afinidad

A

-Permite que una especie de prot. Se retire de la solución mientras que las demas permanecen

Prot que interactuan con Sust. Específicas

  • Se logra la purificación casi total de la molécula en 1 solo paso
  • Tb para purificar prot modificada con una marca en su N o C terminal
50
Q

Marcas comunes

A
  • TAP
  • Glutation - S- transferasa (GST)
  • His (6 his)
51
Q

PAGE

A

Depende de la cap de moléculas cargadas para migrar cuando se colocan en un campo eléctrico

Prot impulsadas por una corriente aplicada a través de matriz gelificada de ACRILAMIDA

Para determinar masa molecular comparando posiciones

52
Q

Electroforesis en gel bidimensional

A
  • se utilizan 2 propiedades dif de las moléculas
  • se separan en gel tubular mediante enfoque isoelectrico
  • el gel se retira y se coloca en placa de poliacrilamida saturada con SDS y sujeto a SDS PAGE
  • se separan mediante su masa molecular
  • La resolución es alta
  • ideal para detectar cambios en las proteínas en dif. Condiciones o en distintas etapas del desarrollo, ciclo celular o dif organismos
  • No es adecuada para distinguir prot con masa elevada
53
Q

Espectrometría

A
  • Para determinar cantidad de proteínas o ácidos Nucleicos presentes en una solución

-mide la cantidad de luz de una longitud de onda específica absorbida por esa solución

  • Instrumento: Espectrofotometro
54
Q

Tirosina y Fenilalanina

A

Absorben la luz en el rango UV con máximo de absorbancia de 280nm

55
Q

Mioglobina

A
  • Primera proteína cuya estructura se determinó por difracción de rayos x se analizo a 6,2 y 1,4 A
  • resolución de 6 a suficiente para demostrar como se pliega la cadena polipéptido

-no suficiente para mostrar la estructura dentro de la cadena

56
Q

CCD

A

Detectores electrónicos altamente sensibles proporcionan una lectura digital de los datos de difracción han reemplazado de las placas fotográficas

  • el uso de instrumentos con las computadoras cada vez más potentes permite recopilar y analizar datos suficientes para determinar la estructura terciaria de proteínas en cuestión de horas
57
Q

Mayor desafío en la cristalografía de rayos X

A

Obtener cristales utilizables

58
Q

La electroforesis en gel se puede usar para

A
  • Separar moléculas con diferentes conformaciones, circulares, lineales, distendidas y súper enrollados
  • para separar ácidos nucleicos de diferente masa molecular (longitud de nucleótidos)
  • solo para moléculas pequeñas de rna o Dña de pocos cientos de nucleótidos o menos
  • moléculas grandes no pasan por el gel de poliacrilamida
  • la sensibilidad alta de la electroforesis en gel permite que las moléculas de RNA/DNA que se diferencian en un solo nucleótido se pueden separar entre sí
  • Método invaluable para la secuenciación de ADN
59
Q

Electroforesis de campo pulsado

A
  • separación de moléculas de DNA mayores a 25 kb se fraccionan en gel de agarosa
  • los fragmentos de DNA se visualizan con tincion de bromuro de etidio
60
Q

Velocidad de sedimentación

A
  • Velocidad a la que una molécula dada se mueve en respuesta a la fuerza centrífuga
  • La la unidad S es igual a un coeficiente de sedimentación de 10-13 seg
61
Q

Centrifugación de equilibrio

A
  • Las moléculas de ácido nucleico se separan en función de su densidad de flotación
  • se utiliza solución concentrada de la sal de metal pesado de cesio
  • usada para separar moléculas de DNA que tienen composición de base diferente o isótopos de nitrógeno diferentes
62
Q

Amplificación enzimática del DNA por PCR

A
  • reacción en cadena de polimerasa
  • utilizando transcriptasa inversa
63
Q

Aplicación de PCR

A

1) amplificar el de enea para la clonación o el análisis

2) pruebas para la presencia de secuencias específicas de ADN

3) comparación de moléculas de ADN

4) cuantificación de las plantillas de ADN o ARN

biologia KARP 8va (6 decks)

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