Separation 2&3 Flashcards
1
Q
Vad är kromatografi?
A
- Kemisk separationsteknik
- Utnyttjar förhållandet ämnen som separeras fördelar sig på olika sätt mellan en stillastående (stationär) och en rörlig (mobil) fas.
2
Q
Hur går kromatografin till?
A
- I början av ett experiment har vi analyten i den mobila fasen
- Men när jämvikten ställer sig in kommer analyten att fördela sig mellan de 2 faserna beroende på analytens egenskaper
3
Q
Kromatografins principer
A
1) Provet tillförs i den fasta fasen
2) Provmolekylerna interagerar olika med den stationära och den mobila fasen pga av att analyterna består av olika saker och kommer att fördela sig mellan den fasta fasen och rörliga fasen.
3) P.g.a. provmolekylernas olika interaktioner separeras dem (De som ska till mobila fasen kommer att röra sig snabbare genom kolonnen mha den mobila fasen som hela tiden flödar genom kolonnen)
4) Ju längre kolonnen, desto längre sträcka har de att separera på.
5) De olika prov molekylerna är nu fullt separerade
4
Q
Varför behövs kromotografi?
A
- Om man inte har en tillräckligt selektiv detektor som kan skilja mellan analyt molekylerna så används kromatografi för att separera ämnena ifrån varandra innan detektion.
- Kromatografi används även för upprening av blandningar.
5
Q
Vad används kromatografi till?
A
- Analys av läkemedel (Ren substans & i kroppen)
- Analys av läkemedelsmetaboliter
- Analys av prover från farmakodynamiska och farmakokinetiska studier
- Upprening av ämnen från naturprodukter för att jobba med t.ex ett syntes mellansteg
6
Q
Principen bakom vätskekromatografi (LC)
A
- En vätskefas pumpas med hjälp av tryck genom en stålkolonn som innehåller partiklar
- Partiklarna tillhör den stationära fasen
- Kolonnen har en diameter på 3-10 µm.
- Separation sker genom att analyterna tillbringar olika lång tid i den stationära fasen.
- Om de interagerar i högre grad med den stationära fasen så kommer de att stanna där längre och tar längre tid att nå detektorn.
7
Q
Uppbyggnad av ett LC-system
A
- En flask: Innehåller den mobila fasen, med en slang är den direkt kopplad till en pump.
- Mellan den mobila fasen och pumpen finns gaser som tar bort luft från mobilfasen så att vi kan få en jämn signal.
- Om vi har flera lösningsmedels flaskor, kan vi blanda de med en mixer.
- Sedan har vi pumpen som ser till att vi har ett kontinuerligt flöde av mobilfasen genom hela kromatografiska systemet
- Ett injektor: Där man injicerar sitt prov som man har i en provbehållare (HPLC vial). Injektionen är ofta automatiserad.
- Därefter förs provet vidare till kolonnen: Där den stationära fasen är packad.
- En förr kolonn: Fungerar som ett filter som separerar analyterna från varandra.
- En ugn: gör det möjlig att ställa in olika temperaturer (Inte för höga temperaturer eftersom den mobila fasen får inte avdunsta).
- Detektorn: Kopplad till ett datasystem som ger upphov till ett kromatogram
- Sist sitter en avfalls flaska.
8
Q
Injektion av analyt
A
- Valv Injektion: Är en injektions princip.
- Där man har en loop (En slinga med en definierad volym som vid Load läge fylls av provet). Vid injektions läge förs all prov över till kolonnen.
- När man gör detta manuellt så måste man ställa om de två lägen själv mha en spruta.
- Syftet med Valv injektion är att förhindra att provet späds ut med mobilfas innan det injiceras.
- Samt att man får en väldigt exakt volym av provet och då behöver man inte använda en intern standard.
9
Q
Storlekar för separationskolonner
A
- Storleken för (Standard HPLC - Den vanligaste) är 100 - 250 mm
- Sensitiviteten ökar med minskad inre diameter av kolonnen.
-En ökad koncentration av analyt minskar kapaciteten.
- För att ökad konc. leder till dålig separation av analyten i provet.
10
Q
Vilka olika material kan kolonnen bestå av?
A
- Silikabaserade packningsmaterial (Vanligast)
- Polymerbaserade faser
Fördelar: Stabilare i ett bredare pH intervall. - Monolitfaser
Fördelar: Har ett större hålrum som mobila fasen kan passera igenom som ger lägre mottryck och då kan vi använda högre flöde för att få snabbare separation.
11
Q
Vad består ett kromotogram av?
A
- X axeln: Detektions tiden (Oftast i min) som talar om hur lång tid det tar för analyten att passera genom kolonnen och detekteras av detektorn.
- Y axeln: Intensitet. Ju flesta detektorer desto större topp area analyten ger upphov till, desto större koncentration av analyten har vi i provet.
Varje topp motsvarar en analyt som detektorn detekterar.
12
Q
Dödtiden (t0)
A
- Är tiden det tar för den mobila fasen att ta sig igenom kolonnen (t0 är beroende på hur lång kolonnen är och flödeshastigheten av den mobila fasen)
13
Q
Retentionstiden (tR)
A
- Är tiden det tar för analyten att ta sig igenom kolonnen
(tR är beroende av hur pass analyten interagerar med den stationära fasen)
14
Q
Retentionsfaktorn (K)
A
- Anger förhållandet mellan tiden analyten tillbringar i stationära och mobila fasen
- Enhetslös
- Används för att identifiera analyter genom att man jämför K-värdet för en känd analyt med K-värdet för en okänd analyt.
15
Q
Resolution (Rs)
A
- För att kunna säga att 2 toppar är fullständigt separerade så måste resolutionen vara 1 - 1.5 eller större.
- Större resolution är inte alltid bättre. Det viktiga är att det är större än 1,5 annars är det ingen resolution.
