Gentechnik (VL5) Flashcards

1
Q

Wie wird ein Microarray hergestellt?
Wozu verwendet man ihn?

A

Herstellung des Microarray

  • Zunächst braucht man die gesamte Genom Sequenz des zu untersuchenden Organismus
  • Durch Computer Analysen ermittelt man die Positionen der Gene in der Sequenz
  • Design von Primern, so dass man durch PCR Kopien der Gene herstellen kann
  • Aufschmelzen der Doppelstränge in Einzelstränge
  • Nun plaziert man Tropfen der einzelsträngigen DNA um geordnete Reihen auf einer Glasplatte zu erstellen
  • Jeder Ort enthält mehrere Kopien der gleichen Sequenz
  • Nun erstellt man eine Datenbank um die Orte der Gene zu dokumentieren

Funktion

  • Man verwendet Microarray um die Unterschiede in der Genexpression zwischen zwei verschiedenen Zelltypen zu ermitteln
  • Dafür wird die Art der mRNA in beiden Zelltypen verglichen
  • Ein Microarray ist ein kleines Stück DNA
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Q

Wie funktioniert ein Microarray?

A

Experiment mit Microarray

  • Zuerst sammelt man die zwei unterschiedlichen Zelltypen die man miteinander vergleichen möchte
  • Nun isoliert man die mRNA aus beiden Zelltypen durch Zentrifugation und das Anheften an Beads
  • Als Nächstes wird eine cDNA Kopie der mRNA angefertigt
  • Die beiden cDNA Proben werden nun zum Microarray hinzugegeben, wobei es zu einer Hybridisierung und Bildung einer DNA kommt, sobald sich 2 komplementäre cDNAs vermischen
  • Die cDNA die nicht hybridisiert wurde wird ausgewaschen
  • Als Nächstes untersucht man mit einem Scanner wo die jeweilige cDNA gebunden wurde
  • Es kann auch DNA auf dem Microarray geben, die mit beiden Proben hybridisieren kann
Microarray Scan
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Q

Wie funktioniert Next-Generation Sequencing?

A

Next Generation Sequencing

  • Als erstes wird eine Probe entnommen und die DNA wird isoliert
  • Nun wird die DNA in kleine Fragmente gespalten zb. durch Enzyme
  • Als Nächstes werden 2 verschiedene Adapter in die Lösung gegeben, die jeweils an ein Ende der DNA Fragmente binden und die Fragmente werden amplifiziert und in Einzelstränge denaturiert
  • Die Fragmente werden auf eine sogenannte Flow Cell gegeben, auf welcher 2 verschiedene Oligonukleotide angebracht sind, die die komplementäre Sequenz der Adapter haben
  • Jedes Fragment bindet an einen der beiden Oligos
  • Die DNA die an die Oligos bindet ist der Gegenstrang und nun wird der Leitstrang synthetisiert und der Gegenstrang weggewaschen
  • Nun ist die gesamte DNA-Bibliothek (Fragmente) an die Flow Cell gebunden und wird amplifiziert um DNA Cluster zu bilden
  • Als Nächstes binden die Stränge an ihrem freien Ende an ein weiteres Oligo und bilden so Brücken (Annealing)
  • Nun wird erneut ein komplementärer Strang an den Einzelsträngen mittels einer DNA-Polymerase gebildet
  • Die DNA wird wieder denaturiert, doch nun sind beide Einzelstränge an die Oligos der Flow Cell gebunden
  • Dieser Prozess wird mehrfach wiederholt (Brücken Amplifikation)
  • Nun werden jeweils die komplementären Stränge wieder ausgewaschen
  • Für die Sequenzierung wird ein Primer, DNA Polymerase und mit 4 unterschiedlich fluoriszierenden Farbstoff markierten Nukleotide hinzugefügt
  • Sobald ein Nukleotid am Strang bindet, wird die Farbe dedektiert (Read) und das nächste Nukleotid kann binden, so lange bis das komplette Fragment sequenziert wurde
  • Als Letztes erfolgt die Datenanalyse, bei der die gesamten Reads überlappt werden und mit einem Referenz Genom verglichen werden
  • Dadurch kann die gesamte Sequenz des Genoms ermittel werden
NGS
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4
Q

Anwendungen von NGS

A

Für die Sequenzierung von

  • Gesamtgenomen
  • 1000 genome project
  • RNA-Seq
  • cancer genomics
  • metagenomics
  • microbiome
  • environmental DNA seq
  • single cell transcriptomics
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Q

Was ist Proteomics? Technik? SILAC?

A

Proteomik

  • umfasst die Erforschung des Proteoms, d.h. der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen vorliegenden Proteine

SILAC

  • Stable Isotop Labeling of Amino Acids in Cell Culture
  • Das Ziel von SILAC ist 2 Proteasomen anhand ihres Molekulargewichts zu unterscheiden

Funktionsweise

  • Es wird je eine Zellkultur in einem Medium mit leichten AS und in einem Medium mit schweren AS gezüchtet
  • Als Nächstes werden die gleiche Anzahl an Zellen jeder Kultur gemischt und lysiert
  • Die Proteine jeder Zelle werden extrahiert und in Fragmente gespalten, die jeweils mit einem leichten oder einem schweren Arginin markiert sind
  • Diese Markierungen können in der Massenspektrometrie erkannt werden und die Ratio der Masse zu ihrer Ladung kann ermittelt werden
  • So können die leichten von den schweren Fragmenten durch ihr Molekulargewicht unterschieden werden
SILAC
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6
Q

Wie kann man die Funktionsweise vieler Gene im Genom untersuchen?

A
  • Enhancer Trap
  • GAL4/ UAS-System
  • RNA Interferenz
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