БСБ изпит 2 Flashcards
(38 cards)
Биологично флуоресцентно белязване
Флуоресцентно белязване с експресия на флуоресцентни белтъци; с въвеждане на модифицирани АК – белязване чрез „сливане“ с флуоресцентен белтък (fusion protein) в процес трансформация/трансфекция.
Биологичното белязване зависи от биологичната съвместимост, способността да се експресира белтъка в клетките и различните варианти на флуоресцентните белтъци.
Какво се използва при биологично флуоресцентно белязване
Използват се различни варианти на GFP (изолиран от Aeguora victoria) и други ф.белтъци. При изолиране GFP флуоресцира без добавяне на екзогенни фактори,; има висока резистентност към детергенти, протеази и високи температури.
Фотоцит
Фотоцити – клетка, свързна с биолуминисценцията.
Aequorin
Фотопротеин, чувствителен към калциеви йони. Може да се използва за детектиране на калциеви йони.
Флуоресцентни белтъци
Те формират свой хромофоф от 3 последователно разположени АК, без да изискват кофактори или ензими. АК-ите са в позиция 65-67 в алфа-спирала колализирана във вътрешността на бета-цилиндър. Хромофорът излъчва във видимата част на спектъра.
За какво се използват флуоресцентите белтъци
Флуоресцентните белтъци се използват за in vivo белязване/детекция. Генът, кодиращ за ф.белтък се свързва с cDNA (комплементарна ДНК), кодираща за даден белтък или пептид и се експресира в различни типове клетки. Локализацията (или динамика на разпределение) в различните части на клетката (органели) се следи с ф.микроскопия.
Хемилминесценция и биолуминесценция
И двете реакции са реакции на окисление и са силно екзергонични! Те включват късане (фрагментация) на О-О връзки в органичен пероксид, който служи като субстрат (по-специфично циклични пероксиди). Пероксидната връзка се къса лесно, след което настъпва молекулно реанжиране, съпроводено с освобождаване на значително количество енергия.
От какво зависи интензитетът на емитирана светлина при хемилуминесценция?
от скоростта на химичната реакция, респективно на концентрацията на реагиращите вещества.
Хемилуминесценция: реакция
Най-често използваните субстрати са луминол (изолуминол, производни). Той се окислява в алкална??? среда с водороден пероксид. Катализаторите за тази реакция са калиев ферицианид, натриев периодат; ензимите са пероксидаза от хрян (HRP); енхансерите са феноли. Ензимите забързват реакцията, енхенсарите увеличават добива.
Видове хемилуминесценция
Хемилуминесценция бива директна и индиректна. Директната (А+ B –>(I) продукти + светлина). При индиректната, когато реагиращото вещество е слаб емитер, се добавя силно флуоресциращ акцептор:
A + B –> (I) * + F –> I + F продукти + светлина
Приложение на луминолова хемилуминисценция: (Луминолът се използва в свободна форма)
А) Детекция на кръв – железните йони забързват реакцията между луминолът и водородният пероксид; пероксидазата от хрян е ензимът
Б) В клинична химия – детекция на лекарства, хормони, специални протеини, туморни маркери, инфекциозни агенти
3) В МБ – детекция на белязани антитела, антигени (имуноанализ)
Акридни естери
Емитират светлина в присъствието на водороден пероксид и натриева основа без участие на енизм. Имат 100 пъти по-висок интензитет на излъчване от луминол. Присъединяват се към различни молекули без това да повлиява интензитета на излъчване.
Кинетика на хемилумининесцентна реакция
flash type reaction & glow type reaction
Най-използваният окислител за хемилуминесценция
водороден пероксид
Enhanced chemiluminescence
Към луминолът се добавят водороден пероксид и пероксидаза, получава се междинно с-ние, добавя се енхансера, което води до второ междинно съединение, след което се излъчва светлина. Усилената хемилуминесценция се постига чрез катализиране на окислението на луминола.
Приложение: определяне на водороден пероксид в разтвор, детекция на ензими, които декомпозират водороден пероксид (каталаза, пероксидаза) или водят до формирането му, определяне на концентрация на железни йони; детекция на ROS и активността на ензими, които ги генерират
Какво е белязване на НК
тяхното маркиране чрез закачване на атомни групи или по-големи молекули чрез ковалентни връзки
Какво е сонда
Белязана по някакъв начин макромолекула, която може да се свързва специфично с биологичната макромолекула, която се търси
Как радиоактивно се бележат НК
32Р
Забелязване се използват изотопи на
сяра (белтъци), азот – АК и белт; С § О = фотосинтеза, дишане ; фосфор – НК
Приложение на белязаните НК
- Блотинг – прехвърляне на някакъв вид макромолекула върху мембрана с цел последващата й детекция (Western blotting). В процеса може да се включва хибридизация (специфично свързване на НК на основа комплиментарността на базите им)
- Скрининг на библиотки
- Свеквениране на ДНК
- Количествена ПВР
- ДНК чипове
Нуклид
вид атом със специфичен брой протони и неутрони
Дефинира се посредством атомния номер и масовото число на елемента
Видове нуклиди
- Изотопи
- Изобари – еднакво масово число (азот, кислород)
- Изомери – еднакъв брой протони, еднакво масово число А (различно енергетично състояние). Ядрото-изомер, което се намира на пио-високо енергетично ниво се нарича възбудено или метастабилно и неговото преминаване в основно състияние при излъчване на излишна енергя се нарича изомерен преход. Излъчваните гама-кванти могат да взаимодействат с орбитален електрон и да го избият от атома.
Нуклеони
протони + неутрони
Съотношението на протоните и неутроните в ядрото..
ядрото определя стабилността – протий и деутерий са стабилни, а тритият е радиоактивен изотоп. Стабилните изотопи не се разпадат. Четността на нуклеоните е желано свойство за ядрената стабилност. В природата всички елементи с Z>83 имат само радиоактивни изотопи
