ביוכימיה 2 חלבונים Flashcards
(282 cards)
1
Q
חלבונים:
A
חלבונים הם המאקרומולקולה הנפוצה ביותר מבין כל המאקרומולקולות , מהווים כ 15% ממשקלו הכולל של התא , והם נמצאים ליטרלי בכל מקום בתא.
הם סוג של ״מכשירים״ מולקולריים
2
Q
כמה חומצות אמינו קיימות בטבע ?
A
בטבע יש קצת יותר מ 300 חומצות אמינו , ביצורים חיים מחיידק ועד בני אדם , משתמשים ב 20 חומצות אמינו כדי לבנות את מרבית החלבונים בתא , להדגיש , כל היצורים משתמשים באותם 20 חומצות אמינו לשם כך , מה שמאפין את ה 20 האלה זה שהם מקודדות בגנום של הייצור
3
Q
סטריאואיזומרים של חומצות אמינו:
A
בכל חומצה אמינית (מלבד גליצין) יש מרכז כיראלי אחד לפחות , ועל כן לכל חומצה אמינית יש שני אננטיומרים: L ו- D
בגוף שלנו יש רק אננטיומר L , ובתוך כך גם החלבונים הם בקונפיגורציית L , בחיידקים גם כן כל החלבונים הם L , מלבד בדופן יש אזורים שבהם יש חומצות אמינו בודדות בצורת D
D-Ala
4
Q
מה ניתן לומר על חומצות האמינו שבונות חלבונים ביצורים חיים ?
A
״החלבונים של כל אורגניזם , מהבקטריה הפשוטה ביותר ועד בני האדם , בנויים מאותו הסט של חומצות האמינו״
5
Q
המגוון הרחב של חלבונים:
A
כאמור המאקרומולקולה הכי נפוצה יחסית לשאר המאקרומולקולות , שכיחות זו בתאים היא הודות למגוון הרחב של התפקידים אותם ממלא החלבון.
החל מתפקיד מבני , כגון קרטין שבונה שערות ציפורניים , קרניים של בעלי חיים ונוצות. חלבון הראטין מבוטא בכל החולייתנים.
וכן תפקידים אנזימטיים , כגון החלבון luciferase שמתבטא בגחליליות , זהו אנזים שמקטלז ריאקציה היי אטפ לחלבון אחר בשם luciferin וגורם להם לזהור בחושך
כמו כן , לחלבונים יש תפקיד באגירה , כמו משפחת חלבוני הגלובין שאוגרים חמצן
6
Q
המגוון הרחב של אנזימים;
A
עד כמה שיש רב כוניות בחלבונים כמשפחה , בתוך משפחת החלבונים אנזימים הם הכי מגוונים , וזה הגיוני כי לכל תהליך יש את האנזים הספיציפי שלו
7
Q
שייר לעומת שייר צד:
A
שייר: מה שנשאר מחומצת אמינו נתונה אחרי שהיא יצרה קשר פפטידי עם חומצת אמינו שכנה , כלומר כל מה שנשאר ממנה פחות מולקולת המים שיצאה , לרבות קבוצת R
שייר צד: קבוצת ה R
8
Q
מבנה של חומצה אמינית:
A
לכל 20 חומצות האמינו בגוף יש את אותו מבנה בסיסי:
- פחמן α כיראלי (מלבד גליצין)
- קצה קרבוקסילי חומצי
- קצה אמיני בסיסי
פרולין היא יוצאת דופן בזה ששיר הצד שלה נסגר על ה back bone שלה לכדי מבנה ציקלי
כל חומצת אמינו באשר היא מורכבת מלפחות שני פחמנים , ה α והקרבוקסילי.
9
Q
כמה שוקלת חומצת אמינו:
A
חומצת אמינו חופשית שוקלת בממוצע 128 דלתון
בתוך קשר פפטידי , אחרי שנפלטה מולקולת מים , משקל ממוצע של חומצת אמינו הוא 110 דלתון
משקל מולקולת מים: 18 דלתון
10
Q
כל חומצות האמינו בגוף נמצאות בקונפיגורציית L ?
A
לא נכון , בכולם חוץ מבגלצין.
בגליצין אין מרכז כיראלי , ולכן אין בכלל שאלה של אננטיומר L ואננטיומר D
11
Q
חומצות אמינו ופעילות אופטית:
A
בגלל המרכז הכיראלי שלהן , ניתן להגיד שכל חומצות באמינו הן בעלות פעילות אופטית ומסיטות אור מקוטב.
כמובן שגליצין היא יוצאת דופן בגלל העדר המרכז הכיראלי ולכן אינה בעלת פעילות אופטית
אני משער גם שפעילות אופטית היא תכונה הנגזרת מכיראליות , ואיננה בלעדית לחומצות אמינו.
12
Q
כיצד קובעים קונפיגורציית L לעומת D ?
A
בסוכרים , מסתכלים על קבוצת ה OH בפחמן הכיראלי הרחוק ביותר מהפחמן הקרבונילי
בחומצות אמינו , מסתכלים על קבוצת האמין , אם היא בצד ימין אז מדובר באננטיומר D , ואם היא בצד שמאל אז מדובר באננטיומר L
13
Q
שקף 10
A
באיור C , קווים אופקיים יוצאים מהמישור , קווים מאנכים נכנסים אליו. זוהי קונבנציה , ולא תמיד משתמשים בה.
בפישר: אנחנו מניחים שקווים עבים יוצאים מהמישור , ומקווקווים נכנסים אליו.
14
Q
מי היא חומצת האמינו הקטנה ביותר , ומיהי הגדולה ביותר ?
A
גליצין היא חומצת האמינו בעלת המשקל המולקולרי הקטן ביותר.
טרפטופאן היא חומצת האמינו בעלת המשקל המולקולרי הגדול ביותר (היא גם החומצה הכי פחות שכיחה בחלבונים).
15
Q
המדד ההידרופטי:
A
מדד יחסי , נע בין מינוס 4.5 לפלוס 4.5
מודד את מידת המסיסות של חומצה אמינית נתונה , ככל שהוא יותר חיובי כך המולקולה פחות מביסה במים, כלומר יותר הידרופובית.
ארגנין: חומצת האמינו המסיסה ביותר
איזוליאוצין: חומצת האמינו ההידרופובית ביותר
שקף 12 + 13
16
Q
מי היא חומצת האמינו הכי נפוצה בחלבונים ?
A
לאוצין
17
Q
כיצד מקובל לסווג חומצות אמינו:
A
לפי הפולריות של קבוצת הצד שלהם , ונטייתם לקיים אינטראקציה עם מים ב pH ביולוגי
בשיטת סיווג זו , 3 החומצות גליצין , פרולין , וציסטאין הן קשות לאפיון חד משמעי , כי אינן מתאימות באופן מושלם לאף קבוצה.
18
Q
מהן חומצות אמינו אליפטיות ?
A
אלו הו חומצות אמינו בעלות שייר צד הידרופובי , אך לא ארומטי
19
Q
כמה חומצות אמינו מכילות קבוצת גופרית S בשייר שלהם ?
A
שתיים ,
מתיונין + ציסטאין
(הם שייכות לשתי קבוצות שונות)
20
Q
3 חומצות האמינו בעלות שייר הצד המסועף הן:
A
ולין , לאוצין , איזוליאוצין
שלשתן אליפטיות.
21
Q
חומצות אמינו ארומטיות:
A
הידרופוביות , מכילות בשייר הצד שלהם טבעת ארומטית.
טבעת ארומטית מכילה רזוננס , וזה מאד מייצב את המבנה של חומצת האמינו , ומקנה להם בידרופוביות.
22
Q
טירוזין
A
שייכת לקבוצת חומצות האמינו ההידרופוביות ארומטיות. בשייר הצד שלה יש קבוצת הדרוקסיל (פנול) , אולם זו בתנאי pH פזיולוגיים אינה מתיינת , ולכן אינה מקנה לחומצה תכונות של אמפיפיליות (אמפיפטיות) ??
לטירוזין יש pKr בסיסי , כך שב pH=10.7 ההדרוקסיל יכול להתיינן ולמסור את המימן שלו והופך להיות טעון שלילית. אי לכך , בתוך קבוצת ההידרופוביות ארומטיות , היא בעלת האינדקס ההידרופתי השלילי ביותר.
טירוזין מסוגלת ליצור קשרי מימן דרך קבוצת ההדרוקסיל שלה , ולכן היא נמצאת הרבה מאד פעמים באתר הפעיל של אנזימים מסויימים.
קבוצת ה OH של טירוזין יכולה גם לעבור זרחון
23
Q
מבין חומצות האמינו הארומטיות , מי היא חומצת האמינו הכי הידרופובית ?
A
פניל אלנין!!
בטירוזין יש OH ובטרפטופאן יש NH ושתי קבוצות אלו מורידות את ההידרופוביות שלהם
24
Q
סדר חומצות האמינו הארומטיות מההידרופובית ביותר להידרופובית פחות:
A
1) פניל אלנין
2) טרפטופאן
3) טירוזין
25
תאר תכונות של טרפטופאן:
שייכת לקבוצת חומצות האמינו ההידרופוביות ארומטיות
היא חומצת האמינו הכבדה ביותר , והכי פחות שכיחה בחלבונים
שייר הצד שלה בנוי משתי טבעות ארומטיות , המבנה נקרא אינדול indole
סופגת הכי הרבה אור UV מבין שלשת הארומטיות
26
ספיגת אור UV:
תכונה של חומרים ארומטיים , ניתן דרך תכונה זו וכן משוואת בר למבר beer lambert לכמת חלבונים (בעצם אם אנחנו יודעים את רצף החלבון , וכמה חומצות אמינו ארומטיות הוא מכיל ומאיזה סוג , לפי רמת הבליעה , נוכל לדעת כמה חלבונים יש).
הודות לקבוצת ההדרוקסיל בפנול הטירוזין והאמין באינדול הטרפטופאן , הן בולעות חותר אור UV מפנילאלנין.
גרף שקף 20
27
חומצות אמינו פולריות לא טעונות:
**צסטאין** היא הכי פחות פולרית והכי פחות מסיסה במים.
הסיבה לכך היא בקבוצת **הסולפהדריל** SH שהיא מכילה. קבוצה זו כן מסוגלת ליצור קשרי מימן עם המים כי קיים הבדל באלקטרוניגטיביות בין גופרית למימן , אך אלו קשרי מימן חלשים יותר מ NOF
סולפהדריל היא חומצה חלשה בעלת pKr בסיסי למדי
סרין ותריאונין עוברות זרחון בשייר הצד שלהם על קבוצות ה OH. נשים לב לתכונה דומה בטירוזין , **אך המזרחנים בשני המקרים הינם שונים**.
28
אילו 3 חומצות אמינו מכילות שייר צד שיודע לעבור זרחון ?
סרין , תריאונין , טירוזין
בגלל תכונה זו נמצא חומצות אלו באתר הפעיל של אנזימים שעוסקים בזרחן (קינאזות?).
אנחנו מורידים את המימן מה OH ושמים במקומו את הזרחן.
29
שייר הצד של צסטאין:
שייר הצד של צסטאין מכיל קבוצת סולפה הידרילית SH:
קבוצה זו היא:
- חומצה חלשה (pKr בערך 8)
- מחזר חזק
בתור מחזר:
הקבוצה עוברת **חמצון** בקלות (מוסרת פרוטון ואלקטרון) , עקב כך נוצר גשר דיסולפידי בין שני צסטאינים שכנים , הדימר הציסטאיני שנוצר נקרא ציסטין.
הקשר הדיסולפידי הוא קשר הידרופובי , קוולנטי , **תיולי** , הפיך שנוצר/נשבר בחמצון חיזור
30
ציסטין;
חומצה אמינית דימרית
(שני ציסטאינים שקשורים בינהם בגשר דיסולפידי תיולי הידרופובי)
31
מהו מצב החמצון חיזור בשייר צד של צסטאין במצב של SH ?
זהו המצב המחוזר , צורת SS זוהי הצורה המחומצנת וההידרופובית
32
אספרגין וגלוטמין:
שייכות לחומצות האמינו הפולריות אך לא טעונות.
שתיהן מכילות בשייר הצד שלהן קבוצת **אמיד** , בקבוצה זו יש רזוננס בין החמצן לחנקן שמונע היווצרות מטען , ולכן אלו הן חומצות פולריות ולא טעונות (שקף 24)
כלומר האמיד מקנה פולריות אך מונע היווצרות מטען
33
צייר קבוצת אמין וקבוצת אמיד:
שקף 24
34
באילו חומצות אמינו יש רזוננס בשייר הצד ?
**ארומטיות** , בטבעת הארומטית
**אספרגין וגלוטמין** בקבוצת האמיד
**היסטדין** בטבעת האמידזול imidazole ?
**ארגנין** בגוואנידיניום ?
35
חומצות אמינו טעונות חיובית:
אלו חומצות אמינו שיש להם קבוצת אמין או חנקן בשייר הצד , אי לכך ב pH ניטרלי הן קולטות פרוטון מהסביבה , **ועל כן מתפקדות כבסיסים**
ה pKr שלהם , למעט הסטדין , הוא גבוה יחסית ונמנה עם הצד הבסיסי.
להסטדין יש pKr=6 ולכן היא מתפקדת כבופר בציטופלסמה + נמצאת באתר הפעיל של אנזימים כי יכולה בקלות למסור/ לקלוט פרוטון
36
היסטדין:
בשייר הצד שלה יש טבעת **ארומטית** שנקראת אמידזול imidazole
37
מבין כל חומצות האמינו בעלות שייר הצד הניתן ליינון , איזוהי השכיחה ביותר ?
38
האם קיים רזוננס בליזין:
מבין חומצות האמינו הבסיסיות (טעונות חיובית ב pH ניטרלי) היא היחידה שאין בשייר שלה רזוננס , וזה מסביר את יכולתה לקלוט פרוטון , כי האלקטרונים של החנקן פנויים לקלוט פרוטון.
39
כיצד ארגנין יכול לקלוט פרוטון כאשר יש בשייר הצד שלו רזוננס ?
היינו מצפים שהרזוננס יעסיק את האלקטרונים החופשיים של החנקן וימנע מהחומצה יכולת לקלוט פרוטון , אולם הרזוננס קיים בין הפחמן **לשניי חנקנים**, כלומר נוכחות חנקן שלישי בשייר הצד מאפשר קליטת פרוטון , כי הוא מבטיח נוכחות זוג אלקטרונים לא קושר
40
חומצות אמינו טעונות שלילית:
אלו הן חומצות אמינו ששייר הצד שלהן **מתפקד כחומצה.** בעצם ב pH ניטרלי הן מוסרות פרוטון ( יש להן pKr קטן מ 7) , ולכן יהיו בעלי מטען שלילי.
41
צוויטריון:
כשאנחנו דנים בצוויטריון בחומצות אמינו אנחנו מראש קובעים שני תנאים:
- שה pH של התמיסה הוא ניטרלי ?
- שחומצת האמינו תהיה ללא שייר צד מתיינן
צוויטריון זה צורון , שיש עליו שני מטענים מנוגדים שקיימים **בו זמנית** (ועל כן צווי).
בחומצות אמינו זה מתקיים ב pH ניטרלי , כאשר שייר הצד לא מתיינן (קבוצה אמינית חיובית וקרבוקסילית שלילית). במצבם הצוויטריוני , חומצות אמינו יכולות לפעול גם כחומצה וגם כבסיס (כלומר חומר אמפוטרי/אמפוליטי).
ב pH ניטרלי קיים שיווי משקל בין המצב הצוויטריוני ללא צוויטריוני של חומצה אמינית , כאשר קבוע שיווי המשקל הוא גדול מ 1 ?? (כלומר יש יותר צוויטריון מאשר לא צוויטריון)
שקף 29 + שקף 30
צוויטריון קיים בין pk1 ל pk2
42
כיצד נראית עקומת טטרציה של חומצה דיפרוטית :
בעלת **שני אזורי** בופר , אחד של קצה האמין ואחד של קצה הקרבוקסיל. כל אחד מהם נראה ומתנהג כמו עקומת טטרציה של חומצה חד פרוטית.
שקף 31: לשים לב לריכוזים ולמספרים , בגלל שזו חומצה די פרוטית , נדרשים שני אקוויולנטים של בסיס כדי לסתור אותה לגמרי
43
צייר חומצה אצטית:
CH3-CO-OH
44
רמות שונות של חמצון:
חמצון של כוהל R-OH נותן אלדהיד
חמצון של אלדהיד R-CH=O נותן חומצה קרבוקסילית R-COOH
בכוהל הפחמן קשור לחמצן אחד , באלדהיד הפחמן קשור לחמצן אחד בשני קשרים
בחומצה קרבוקסיחית הפחמן קשור לשני חמצנים
45
ב pH פיסיולוגי , מה יהיה מצב הפרוטונציה של חומצת אמינו נתונה , בהנחה שאין לה שייר צד שמתיינן ?
הערך של pK1 הוא בין 1.8 ל 2.4
הערך של pK2 הוא בין 8.8 ל 11
ולכן ב pH פיסיולוגי של 7.4 רוב הקצה האמיני יהיה במצב protonated , ויהיה בעל מטען חיובי , ורוב הקצה הקרבוקסיליה יהיה de protonated ולכן טעון שלילית (צוויטריון ?)
הקצה האמיני הוא אפוא ״חומצה״ הרבה יותר חלשה מהקצה הקרבוקסילי
46
מה יהיה המטען על חומצת אמינו ב pH נמוך מאד ?
חיובי:
1) שני הקצוות יהיו במצב protonated , ולכן על הקצה אמיני יהיה מטען חיובי , ועל הקצה הקרבוקסילי לא יהיה מטען כלל , ולכן סך הכל המטען יהיה חיובי
2) במידה ויש שיירי צד , אם מדובר בחומצות בסיסיות אז גם הם יהיו חיוביות בגלל שהן יהיו protonated , בעוד חומצות אמינו בעלי שייר צד חומצי שיהיו במצב protonated גם כן ולכן יהיו חסרות מטען (לוודא מו טבלה)
אפשר לשחק עם הקונספט במבחן , אם אומרים שהמטען על חומצת האמינו למשל הוא חיובי , אז ניתן להסיק שמדובר בסביבה חומצית מאד , או אם נתון שהסביבה חומצית מאד ניתן להסיק על המטען.
ברגע שמגיעים לטווח הבופר הראשון , יהיה לנו שוויון ריכוזים בין הקצה הקרבוקסילי ה protonated וה de protonated , ולכן בקצה הזה יהיה חלק טעון שלילית וחלק נייטרלי , ומבחינת חומצת האמינו חלק יהיה טעון חיובית (כשהקרבוקסיל protonated) וחלק יהיה ניטרלי (כאשר הקרבוקסיל de protonated )
47
ב pH גבוהה מאד , מה יהיה המטען על חומצה אמינית ?
שלילי
כיוון חשיבה , ב pH גבוה יש הרבה OH בסביבה , שהוא טעון שלילית , וכנראה יותר נוח לחומצת האמינו לחיות בתנאים כאלה.
48
מדוע ערכי ה pK1 ו- pK2 שונים בין חומצות אמינו שונות ?
הערכים שלהם הם די דומים , אך לא זהים כי הערך המדוייק מושפע מקבוצת ה R של החומצה הנתונה , גם אם איננו מתיינן
49
נקודה איזואלקטרית:
הגדרה: **ערך ה pH של התמיסה שבו המטען נטו על חומצת האמינו הוא 0**
עבור חומצה די פרוטית , הנקודה האיזואלקטרית היא הממוצע של pK1 ו- pK2
50
טטרציה של חומצה טרי פרוטית:
אם בחומצה די פרוטית עקומת הטטרציה הציגה שני טווחי בופר שנראים ומתנהגים כאילו מדובר בשתי חומצות חד פרוטיות נפרדות , בחומצה טרי פרוטית זה שונה.
בעקומת טטרציה של חומצה טרי פרוטית קיים מיזוג בין טווחי הבופר השונים:
1) אם מדובר בחומצה אמינית טרי פרוטית שלילית (חומצית) , ה PI יהיה ממוצע בין pK1 ל pKr
2) אם מדובר בחומצה אמינית טרי פרוטית חיובית (בסיסית) , ה PI יהיה ממוצע בין pKr ל pK2
**עדיין אנינו מתייחסים לכך שלחומצה , למרות המיזוג , יש 3 טווחי בופר**
שקף 41 + שקף 43
51
חלבונים וקשר פפטידי , מספר עובדות:
1) קשר פפטידי נוצר בריאקציית דחיסה בין הקרבוקסיל של ח״א x לאמין של ח״א x+1. במהלך הריאקציה נפלטת מולקולת מים , הקבוצה הקרבוקסילית של חומצה אחת תורמת OH , והקבוצה האמינית של השניה תורמת מימן.
**קשר פפטידי אי לכך הוא קשר אמידי**
2) קשר פפטידי הוא קשר יחיד בעל תכונות של קשר כפול: קצר יותר וחזק יותר , אינו מאפשר סיבוב חופשי , מישורי ?
3) מבנה ראשוני של חלבון אינו לינארי באמת , בין חומצות האמינו שמרכיבות אותו יש זוויות (פסאי/פי/אומגה)
4) בפפטיד **תמיד** נמצא קצה אמיני אחד חופשי וקצה קרבוקסילי אחד חופשי , ב pH פזיולוגי שניהם יהיו טעונים. האמיני יהיה protonated ולכן טעון חיובי והקרבוקסילי de protonated ולכן טעון שלילי
5) בקשר פפטידי קיים רזוננס בין 3 אטומים , הרזוננס הוא הודות לאלקטרונים הלא מזווגים של החנקן , המימן תורם לרזוננס אך לא משתתף בו
52
כיצד נוצר הקשר הפפטידי:
**בריאקציית דחיסה אנזימטית**
האמין של קבוצה אחת פועל כנוקליאופיל חזק (האלקטרונים הבלתי מזווגים של החנקן) , **הוא תוקף** את הפחמן הקרבוקסילי שיש עליו מטען חיובי חלקי הודות לקשר עם חמצן (ולכן הוא אלקטרופיל) , בתהליך יש סילוק של OH
במילים אחרות החומצה התוקפת היא x+1 , והחומצה המתקפת היא x (שקף 47).
ה OH אינו רוצה להתנתק , טוב לו הקשר עם הפחמן , ולכן למרות שהאמין הוא נוקליאופיל טוב , בתנאים פסיולוגיים הריאקציה אינה מתרחשת לבד ודורשת אנזים.
כדי שהריאקציה תתרחש עש צורך לשפעל את הקצה הקרבוקסילי בעזרת מולקולת אמפ AMP
53
ריאקציית דחיסה במהלכה נפלטת מולקולת מים היא אי לכך ריאקציית:
דה הידרציה
54
חלבון לעומת פוליפפטיד:
פוליפפטיד: רצף חומצות אמינו בעל משקל מולקולרי קטן מ 10000 דלטון
חלבון: רצף חומצות אמינו בעל משקל מולקולרי גדול מ 10000 דלטון
55
פירוק חלבון לעומת יצירתו:
הידרוליזה של קשר פפטידי , כלומר הפירוק שלו , הינה תהליך אקסרגוני (ספונטני) , כי זה מעלה את האנטרופיה. אך למרות זאת , הריאקציה מתרחשת באופן איטי מאד , מכיוון שיש לה אנרגיית אקטיבציה גבוהה מאד
היציבות אי לכך של קשר פפטידי היא יציבות קנטית , ולכן פירוק חלבון דורש אנזים
זמן מחצית החיים של קשר פפטידי , הודות ליציבות הקנטית היא כ 7 שנים בתנאים תוך תאיים
56
החלבון הקטן ביותר בבני אדם ?
ציטוכרום c
שקף 51
57
שיטת acid hydrolysis:
כנראה שזוהי שיטה שלפיה מגלים את הרכב חומצות האמינו בחלבון מסויים.
3 נקודות חשובות:
- לפי שיטה זו לא ניתן להבדיל בין אספרגין ואספרטט asp ו- asn
- לא ניתן לזהבדיל בין גלוטמין וגלוטמט glu ו- gln
- טריפטופאן נהרסת במהלכה ולכן נדרשת שיטה נוספת כדי לבדוק כמה ממנה קיים.
58
חלבונים מצומדים:
חלבונים הקשור אליהם **באופן קבוע** ובלתי הפיך מרכיב כימי נוסף , שאינו חומצה אמינית , במצב זה הרכיב הנ״ל נקרא **קבוצה פרוסטטית**.
במידה והרכיב הכימי נקשר **באופן הפיך** , ואינו מהווה מרכיב קבוע במבנה החלבון , הוא יקרה **קו אנזים**
חלבונים יכולים להכיל יותר מקבוצה פרוסטטית אחת.
59
מה ההבדל בין קבוצה פרוסטטית לקו אנזים ?
קבוצה פרוסטטית הינה קבועה ולא ניתנת לניתוק , קו אנזים קשור בצורה הפיכה.
60
קבוצת heme בהמופרוטאינים היא:
קבוצה פרוסטטית / קו אנזים ?
קבוצה פרוסטטית.
61
ממה מורכבת קבוצת heme בהמופרוטאינים ?
Iron porphyrin
62
מבנה החלבון:
1) מבנה ראשוני: רצף חומצות האמינו שקשורות בקשרים פפטידיים + קשרים דיסולפידיים ליצירת פוליפפטיד.
2) מבנה שניוני: התארגנות הפוליפפטיד הנ״ל לכדי מבנים אזוריים מוגדרים , כגון סלילי אלפא.
3) מבנה שלישוני: זהו המבנה המקופל והמרחבי של החלבון , כאשר המבנים השניוניים שנוצרו מתארגנים בצורה מרחבית.
4) כאשר מספר תת יחידות (בעלות מבנה שלישוני) מתחברות יחדיו ליצירת
Multi subunit protein
לכל החלבונים חייב את 3 הראשונים , מבנה 3 הוא המבנה הפונקציונלי , אך לא לכל החלבונים יש מבנה רביעוני.
63
מבנה ראשוני:
הדבר שהכי מעניין אותנו , והוא הדבר הכי דטרמנטלי בדיון על מבנה ראשוני של חלבון הוא **הרצף** , בעצם רצף חומצות האמינו שמרכיבות את השרשרת הפפטידית.
המבנה הראשוני יקבע בהמשך את המבנה השלישוני של החלבון.
מבנה ראשוני מורכב רק מקשרים קוולנטיים: פפטידיים + דיסולפידיים.
אותו חלבון יכול להיות מורכב מרצף חומצות אמינו שונה בין פרטים שונה באותה אוכלוסיה , חלבונים כאלה נקראים חלבונים פולימורפיים.
64
חלבון פולימורפי:
כאשר מדובר באותו סוג חלבון , אך נמצא שבין פרטים שונים באותה אוכלוסיה , מבנהו הראשוני הוא שונה , כלומר קיים הבדל ברצף חומצות האמינו שמרכיבות אותו , הדבר אינו משפיע בצורה סגנפיקנטית על התפקוד.
בין 25% ל 30% מהחלבונים בבני אדם הם פולימורפיים
בד״כ נמצא שהשומי קיימים באזורים שהם פחות קריטיים עבור תפקוד החלבון , כאשר אזורים כאלה , נוטים להיות יותר שמורים.
65
האם , **במינים שונים** , חלבונים המבצעים פונקציות דומות חייבים להיות זהים , או דומים ?
לא!
״ישנם חלבונים **המבצעים פונקציה דומה** במינים הרחוקים מאד אחד מהשני , והם יכולים להיות שונים מאד בגודל הכולל שלהם וברצף חומצות האמינו״.
66
כיצד נוצר מבנה שניוני של חלבון ?
הגדרה: אלמנטים סטרוקטורליים חוזרניים ויציבים , שנוצרים ע״י **כיפופים ועיוותים** בשלד הפפטיד , ומייצגים מבנה מרחבי **מקומי.**
המבנה השניוני **מוחזק ומיוצב** ע״י קשרי מימן שקיימים בין קבוצות CO ו- NH של **שיירי** חומצות האמינו שמרכיבות את הפפטיד
67
הגדר מבנה שלישוני:
מבנה שלישוני של חלבון מתייחס לכל האספקטים של הקיפול התלת מימדי של החלבון
- קשרים שמחזיקים אותו , שיקולים תרמודינמיים , יציבות , קונפורמציו , וקונפיגורציה וכו׳
עקרונית , עבור חלבון נתון יתכן מספר בלתי מוגבל של **קונפורמציות** שהוא יכול להתקיים בהם , כתלות בתנאי הסביבה. בפועל , בתנאים ביולוגיים קיימת **קונפורמציה** אחת שהיא הכי יציבה תרמודינמית (בעלת דלתא ג׳י הנמוך ביותר) שהחלבון יקבל , מצב זה נקרא ״מבנה נאטיבי״
קונפורמציה , היא תכונה מרחבית של החלבון , כאשר המעבר מקונפורמציה אחת לשניה אינו דורש שבירת קשר קוולנטי , אלא נובע מיכולת תנועה חופשית סביב **קשר קוולנטי יחיד.**
לחלבון יש מספר סידורים מרחביים שיכולים להיות לו , בתנאים מסויימים תהיה העדפה לסידור אחד על פני האחרים.
68
כיצד שונה מבנה שניוני של חלבון ממבנה שלישוני ?
במבנה שניוני: הקשרים המחזיקים את המבנה הם **קשרי מימן** בין שיירי חומצות אמינו סמוכות , ללא השתתפות של שיירי צד. **קבוצות ה R פונות החוצה מהציר המרכזי של המבנה**
במבנה שלישוני: המבנה מיוצב ע״י אינטראקציות בין **שיירי הצד** של חומצות האמינו , אי לכך , כל סוגי הקשרים קיימים , לפי תכונות קבוצת ה R , ולא רק קשרי מימן.
69
האם , בתנאי סביבה מסויימים , תהיה לחלבון קונפורמציה אפשרית אחת ויחידה ?
לא !!
התפקוד של חלבונים רבים דורש שינוי בקונפורמציה שלהם. הדבר קורה למשל בעת קישור סובסטר מסויים לאנזים או לקולטן , שמשרה שינוי מבני קונפורמטיבי בחלבון , **ללא צורך בשבירת קשר קוולנטי**.
כדי שיהיה מעבר בין קונפורמציות , צריכה להיות לכך הצדקה תרמודינמית , כלומר לא יתכן שהקונפורמציה החדשה תהיה בעלת דלתא ג׳י גבוה מזו של הקודמת (אלא אם כן יש צימוד?)
**שינוי בקונפורמציה של החלבון יכול להתרחש רק בחלק ממנו , ויכול להתרחש בכל החלבון**
70
הגדר מבנה נאטיבי של חלבון:
חלבון בצורתו המקופלת כראוי **והפונקציונלית**
יציבות של חלבון: יכולתו לשמור על מבנהו הנאטיבי. (מדובר ביציבות תרמודינמית)
71
משיקולי אנטרופיה , האם חלבון מעדיף להתקפל או להישאר במבנהו הבלתי מאורגן ?
עבור החלבון (שהוא בעצם המערכת) , ההעדפה התרמודינמית (אנטרופית) היא לא להתקפל.
אנטרופיה היא מדד של אי סדר , אנחנו יכולים לתאר אי סדר במונחים של:
1) האקראיות שבה תהליכים יכולים להתרחש במערכת תרמודינמית , ככל שהתהליכים יותר אקראיים ורנדומליים , האנתרופיה יותר גבוהה.
2) מספר האפשרויות בהן מערכת תרמודינמית יכולה להתארגן , יותר אפשרויות , אנתרופיה גבוהה יותר.
3) רמת החופש במערכת
הואיל ולחלבון לא מאורגן (פתוח) יש מספר אפשרויות רב לפיהן הוא יכול להתקפל , משמע האנטרופיה של חלבון פתוח גבוהה מזו של החלבון הסגור , ולכן נטייתו של החלבון היא לא להיסגר. בנוסף לכך , ישנם חומצות אמינו במבנה החלבון שיכולות לקיים אינטראקציות עם המים בסביבה , וזה מייצב את המערכת במצבה הפתוח.
מדומני , סגירת החלבון מעלה את האנטרופיה בסביבה , קיפול מסתיר אתרים הידרופוביים בחלבון , ומשחרר יותר מולקולות מים , מה שאומר שיש להם יותר תנועה רנדומלית , וזה מספק את הכח המניע לקיפול החלבון.
שקף 62
72
האם מבנה מאורגן (מקופל) של חלבון דרוש לתפקוד שלו ?
כן !
מלבד מקרים בודדים בהם נראה שהחלבון איבד את מבנהו המאורגן , אך הוא ממשיך להיות פונקציונלי.
73
קשרים דיסולפידיים ומבנה של חלבון:
אנחנו מתייחסים לקשרים די סולפידיים , פר הגדרה , כחלק מהמבנה הראשוני של חלבון , אולם , הם משתתפים בייצוב המבנה השלישוני שלו גם כן !!
**ככלל , כל סוגי הקשרים קיימים במבנה שלישוני ומשתתפים בייצוב שלו**
בתוך התא: קיימים תנאים מחזרים , כלומר יש איזשהו צורון כזה או אחר שיתרום מימן (כגון גלוטטיון) , ולכן אנחנו נמצא שקבוצות הסולפהדריל יהיו במצב מחוזר SH
מחוץ לתא: התנאים הם מחמצנים , ולכן נמצא שקבוצות הסולפהדריל ימסרו את המימנים שלהם למולקולות אחרות , ועל כן נמצא אותם במצב תיולי של SS
ביוקריוטים קשרים די סולפידיים בחלבונים נוטים להתקיים בחלבונים המופרשים מחוץ לתא כגון אינסולין. הם אינם נפוצים גם בפרוקריוטים מלבד כאלה שחיים בתנאי קיצון כגון ארכיאה וחיידקים תרמופיליים.
אסוציאציה: **תחזור** פנימה , בתוך התא תנאים **מחזרים**
74
מהם הקשרים העיקריים שמחזיקם מבנה שלישוני של חלבון ?
בעיקר אינטראקציות בין מולקולריות , ובעיקר אנטראקציות הידרופוביות.
נכון שבייצוב מבנה שלישוני של חלבון משתתפים כל סוגי הקשרים , לרבות קשר קוולנטי , אך הודות למספרם הרב יותר , דווקא הקשרים הבין מולקולריים (שפר קשר הם הרבה יותר חלשים) , הם אלה שתורמים ליציבות המבנה השלישוני של החלבון יחסית לקשרים קוולנטיים.
בתוך הקשרים הבין מולקולריים , **אינטראקציות הידרופוביות** תורמות הכי הרבה לייצוב המבנה השלישוני , כלומר הדחיה מפני המים , היא זו שדוחפת את החלבון להתקפל והיסגר.
75
מדוע חלבונים מתקפלים ?
החלבון עצמו מעדיף לא להתקפל , כפי שכבר דיברנו בכרטיס 71
אז איך בכל זאת הוא מתקפל בסביבה מימית ?
חלבון פתוח מכיל אזורים הידרופוביים רבים , אלה משפיעים על המים בשני אופנים:
1) דורשים מהמים יצירת ״שכבת המסה״ (הכלוב) וזה מביא עימו ירידה באנטרופיה של המים (הסביבה)
2) שוברים את קשרי המימן בין המים מבלי לספק פיצוי כלשהו , אמרנו שמערכת שמכילה פחות קשרים בין / תוך מולקולריים , הדבר מעלה את האנתלפיה.
כלומר נוכחות חלבון לא מקופל במדיום מימי מוריד את האנטרופיה ומעלה את האנטלפיה = נוגד את כל חוקי התרמודינמקה , ולכן המים **דוחים** את האזורים ההדרופוביים בחלבון ומניעים אותם להיסגר , כך החלבון מתקפל , העליה בסדר בחלבון מפוצה בעליה באי סדר במים (ובירידה באנתלפיה).
76
הליבה של החלבונים היא הידרופובית , איזה חומצות אמינו סביר שנמצא שם ?
- Trp
- Leu
- Ile
- Val
- Phe
במבנה הראשוני של החלבון המיקום של חומצות אלו הוא כזה שבעת הקיפול שלו הם יוצרים ליבה הידרופובית
שקף 65
77
הזוויות שבין רצף חומצות האמינו של חלבון:
אמרנו שרצף חומצות האמינו הוא האלמנט המהותי בדיון על מבנה ראשוני של חלבון , והוא זה שקובע את אופן הקיפול לכדי **מבנה נאטיבי**.
בין החומצות האמיניות שמהוות את המבנה הראשוני קיימות 3 זוויות , שתיים מהם , psi ו- phi , הינן גמישות ויכולות לנוע זו ביחס לזו , **תנועה זו חשובה ליצירת עיוותים בשלד הפפטיד , מה שנותן יכולת ליצירת מבנים שניוניים**
בין כל שני פחמני אלפא עוקבים ברצף ראשוני ישנם 3 קשרים קוולנטיים:
1) קשר ראשון: קשר בין פחמן קרבונילי לפחמן האלפא הראשון , קשר יחיד בעל יכולת סיבוב חופשית , מתואר לפי הזווית psi Ψ
2) הקשר הפפטידי: קשר ריזונטיבי בעל תכונות של קשר זוגי , אינו מאפשר סיבוב חופשי. על החנקן נמצא מטען שלילי חלקי (או שהוא ניטרלי הודות לרזוננס) , מתואר ע״י הזווית omega ω
3) קשר בין האמין לפחמן אלפא השני , קשר יחיד בעל יכולת סיבוב חופשי , מתואר ע״י הזווית phi Φ
78
מה קובע מבנה שלישוני לעומת מבנה שניוני;
מבנה שלישוני: **רצף חומצות האמינו עצמו**.
(מיקום חומצות האמינו וסוג שייר הצד שיש עליהן קובע את האינטראקציות הידרופוביות בליבת החלבון , מה שמייצב אותו).
מבנה שניוני: מידת הגמישות של שתי הזוויות פסאי ופי , אלו זוויות שאינן מוגבלות למישור , ויכולות לנוע זו ביחס לזו. גמישות זו חשובה לצורך יצירת מבנה שניוני הדורש עיוותים של השלד הפפטידי.
79
האם כל הקשרים הבודדים על פחמן אלפא הם בעלי יכולת סיבוב חופשית ?
לא ולא !!
הקשר הפפטיד ( אינו נמצא על פחמן אלפא) אמנם קשר יחיד , אך הוא בעל תכונות של קשר כפול ועלן כן rigid
יכולת הסיבוב החופשית על הקשר הבודד שמחבר בין פחמן אלפא לשייר הצד R תלויה בגודל ומטען קבוצת הצד
שני הקשרים האחרים (זוויות psi ו- phi) הם כן בעלי יכולת סיבוב חופשית
80
הערך של זוויות psi ו- phi:
כעיקרון , הזוויות יכולות להיות בעלות כל ערך שבין 180 ל -180
כאשר האטום הראשון והרביעי (שהם בעצם שני פחמני אלפא) נמצאים הכי רחוק אחד מהשני , ערך הזוויות פסאי ופי הוא 180 ו- -180.
סיבוב של אחד האטומים הנ״ל בכיוון השעון , מגדיל את הזווית של ה -180
(שקף 67 d)
81
הקשר הפפטידי ורזוננס:
שקף 67 , איור a מראה את הרזוננס , ואת האטומים שמשתתפים בו !
הרסוננס מקנה לקשר הפפטידי תכונות מישוריות וקשיחות , ולכן אין סיבוב חופשי
82
זוויות דהידרליות:
אלו הן 3 הזוויות שקיימות בין שני פחמני אלפא עוקבים , פסאי , פי ו- אומגה.
זוויות אלו קובעות את הקונפורמציה של החלבון.
83
האם כל ערך של זוויות psi ו- phi הוא אפשרי ?
לא
כעיקרון הם יכולות לקבל כל ערך בין 180 ל -180
פחמני אלפא יכולים לזוז זה ביחס לזה וזה משנה את ערך הזוויות פסאי ופי שבינהן.
יכולת הסיבוב של שני פחמני אלפא אינה מוחלטת ומוגבלת לפי שיקולים סטריים שנקבעים ע״י קבוצות ה R , העיקרון הוא ששתי קבוצות ה R לא אמורות להפריע אחת לשניה (מטען/נפח) , זווית מסויימת שיוצרת הפרעה סטרית בין שני האטומים לא תוכל להתקיים , ולכן קונפורמציות מסויימות לא יכולות להתקיים בפועל.
דיאגרמת ראמצ׳נדרן: מתארת את הערכים האפשריים של פסאי ופי - בעצם לפי זה מיתן לדעת איזה קונפורמציות של הפפטיד הן אפשריות.
שקף 69
84
מה קובע את מידת היציבות של מבנה שניוני ?
מידת השינוי בשתי הזוויות psi ו- phi
כדי שמבנה שניוני יהיה יציב , ועל כן קיומו יתאפשר , **נדרשת מידת שינוי מועטה מאד** בשצי הזוויות הנ״ל בעת היווצרותו , זה למה סלילי אלפא ומשטחי בטא הם יציבים.
משנוצר המבנה , קשר מימן מייצבים אותו
85
Random coil:
מונח המתאר מבנה שניוני של חלבון שאינו מוגדר כסליל אלפא או משטח בטא. המבנה אינו רנדומלי באמת , ונקבע לפי תכונות הפפטיד , אולם בגלל שהוא פחות נפוץ משני האחרים כך הוא נקרא.
(רנדום קויל מציג שינוי גדול בזוויות דהידרליות ?)
86
12 עובדות שלא ידעתם על סליל אלפא:
עמ׳ 36
*1) כל סיבוב בסליל אלפא מכיל 3.6 חומצות אמינו , והוא חוזר על עצמו כל 5.4 אנגסטרום (כלומר המרחק בין שתי נקודות במיקום זהה בסליל הוא 5.4 אנג׳)
2) המרחק בין שתי חומצות אמינו עוקבות בסליל הוא 1.5 אנגסטרום , וזווית הסיבוב בינהם היא 100 מעלות
3) שיירי הצד של חומצות האמינו פונים החוצה
4) הסליל אינו חלול , אלא שיש בו אלקטרונים
5) הסליל הוא בעל מבנה דחוס , כלומר האטומים שבונים אותו הם ממש קרובים אחד לשני
6) המבנה ממקסם את השימוש בקשרי מימן פנימיים , ולכן הכי נפוץ מבין המבנים השניוניים , למעשה כ 25% מחומצות האמינו בפפטיד נתון נמצאות במבנה של סליל אלפא
7) הציר המרכזי של הסליל יכול להיות מעט כפוף , בעל kink , וזאת בגלל סטיה קלה מהזוויות הדהדרליות
8) קשרי המימן שמייצבים את המבנה הם בין חומצות אמינו במרחק x+4 זו מזו. כלומר בין חומצה בעמדה 1 לחומצה בעמדה 5
*9) כל סיבוב בסליל מחובר ב 3 עד 4 קשרי מימן חסיבובים הסמוכים אליו , וזה מייצב את מבנה הסלילי
10) בחלבונים יש סליל בעל סיבוב ימני שבנוי מחומצות אימנו בקונפיגורציית L , בתאוריה יתכן גם סיבוב שמאלי , הוא יהיה בנוי מחומצות בקונפיגורציית D
11) בסליל נתון , כל חומצות האמינו יהיו מאותה קונפיגורציה , L או D , אך לא שתיהן
12) לרוב נמצא שחומצות האמינו שליד הקצוות של הסליל יכילו קבוצות צד בעלות מטען מנוגד לקצה עצמו , למשל סמוך לקצה האמיני נמצא חומצא טעונה שלילית , מה שנותן אפקט מייצב.
87
מבנה שניוני הוא מבנה מרחבי מקומי:
מבנה שניוני לא אומר שכל החלבון קיבל את המבנה , אלא שאזורים מסויימים בו התקפלו בעוד שאחרים נותרו ישרים ופתוחים.
בפפטיד נתון יתכנו מספר מבנים שניונים שקיימים במקביל
88
סליל אלפא וחומצות אמינו ספיציפיות:
1) פפטידים המכילים אלאנין בשכיחות גבוהה נוטים הכי הרבה ליצר סלילי אלפא , הדלתא ג׳י הסטנדרטי במצב זה יהיה 0 (שקף 47)
2) פפטידים המכילים פרולין נוטים הכי פחות ליצר סלילי אלפא בגלל המבנה של החומצה שיוצר כיפוף לא יציב בסליל + חוסר זמינות החנקן ליצירת קשר מימן
3) גליצין בגלל המבנה הקטן שלה מקנה לסליל גמישות יתר ולכן פוגמת ביציבות שלו. פפטידים המכילים גליצימים רבים נוטים לייצר מבנים סליליים שונים מאלפא
4) רצף חוזרני של חומצות אמינו פולריות , בייחוד של סרין, תריאונין, צסטאין ו- אספרגין פוגע ביציבות הסליל , כגון ser-ser-ser-
5) חומצות אמינו ארומטיות המופרדות זו מזו במרווח של 3 ח״א יכולות ליצר אינטראקציה הידרופובית מייצבת
6) חומצות אמינו חיוביות המופרדות מחומצה אמינית שלילית במרווח של 3 ח״א יכולות ליצר זיווגים יוניים מייצבים
הסיבה לתופעה המתוארת בסעיפים 5 ו- 6 היא בגלל שבמיקום הזה השיירים של החומצות הנ״ל יהיו זה מעל זה , וייצרו אינטראקציות בינהם , אמנם קשרי המימן שמחזיקים את המבנה השניוני הם לא של קבוצות הצד אלא של השייר , אך אופי קבוצות הצד משפיע על יציבות / חוסר יציבות הסליל.
89
השפעת pH על מבנה סליל אלפא:
רצף פפטידי שמכיל חומצות אמינו טעונות יכול לייצר מבנה של סליל אלפא ב pH מסויים אך לא ב pH אחר:
1) **אצף חומצות טעונות חיובית**: ב pH ניטרל השייר שלהם יהיה טעון , הדבר יוצר דחיה בין קבוצות ה R ולכן הם לא יצליחו לייצר סליל אלפא. ב pH גבוהה השייר מוסר פרוטון והופך להיות ניטרלי ולכן יצליחו ליצר סליל אלפא.
2) **רצף חומצות אמינו שליליות:** ב pH ניטרלי הם מוסרות פרוטון , ומקבלות מטען שלילי ולכן לא יצליחו ליצר סליל אלפא בגלל דחיה חשמלית , ב pH נמוך (חומצי) הם יהיו protonated ולכן יצליחו ליצר סליל אלפא
התופעה רלוונטית למצב שבו יש רצף חומצות טעונות
90
5 עובדות שלא הכרתם על משטחי בטא:
1) המבנה אינו ישר אלא בעל צורת זיגזג הודות לשתי הזוויות הדהדרליות psi ו- phi
2) ערך הזוויות מושפע מקבוצות ה R שעל פחמני אלפא , שקובעים את מיקומם אחד ביחס לשני
3) כל מקטע בודד נקרא בטא strand , מספר strands שמסתדרים יחדיו יוצרים מבנה של בטא sheet , גם בסטרנד וגם בשיט קבוצות ה R פונות החוצה
4) קבוצות ה R של חומצות אמינו סמוכות יהיו בצורת טרנס אחת יחסית לשניה , כלומר יפנו בשני כיוונים מנוגדים
5) אזורים הדרופוביים בפפטיד נוטים ליצר משטחי בטא
91
משטח בטא מקביל לעומת משטח בטא אנטי מקביל:
1) משטח מקביל:
- פחות יציב
- אורך היחידה החזרתית הוא 6.5 אנגסטרום
- קשרי המימן הם אלכסוניים
2) משטח אנטי מקביל:
- יותר יציב
- אורך היחידה החזרתית הוא 7 אנגסטרום
- קשרי המימן הם ישרים (ועל כן יותר חזקים)
92
סיבוב בטא
Beta turn
1) אלו הם מבנים המחברים בין משטחי בטא סמוכים **אנטי מקבילים**
2) מורכב מ 4 חומצות אמינו
3) קיימים שני סוגים עיקריים , **אך הם לא היחידם** , הם נבדלים זה מזה בכמה תכונות , לרבות ערך הזוויות psi ו- phi שבין פחמני אלפא:
- סוג 1 נפוץ פי 2 יותר מסוג 2
- סוג 1 יש בו פרולין בעמדה 2
- סוג 2 יש בו גליצין בעמדה 3
בשני הסוגים קיים קשר מימן מייצב בין ה CO **בעמדה 1** ל NH **בעמדה 4** , עמדות 2 ו- 3 לא מייצרות קשרי מימן פנימיים זו עם זו , אלא עם מולקולות מים מהסביבה.
4) סיבוב בטא נמצא לעיתים קרובות ליד פני השטח של החלבון
שקף 80
93
הקשר בין שיירי ה R לבין הזוויות הדהידרליות:
שיירי R שקשורים לפחמני אלפא מגבילים את יכולת הסיבוב שלהם אחד ביחס לשני משיקולים סטריים.
לפי כך , נקבעים הערכים של הזוויות הדיהדרליות פסאי ופי
וזה קובע את סוג המבנה השניוני שיכול להיווצר , לרבות סיבובי בטא
94
סיבוב גאמא:
- מורכב מ 3 חומצות אמינו
- הכי פחות נפוץ
- קשר מימן קיים בין עמדה 1 לעמדה 3
95
מבנה שלישוני:
ההתארגנות המרחבית **הכללית** של האטומים בחלבון
להבדיל ממבנה שניוני שמתייחס להתארגנות מרחבית **מקומית**
המבנה מוחזק הודות לקשרים בין מולקולריים וקשרי SS בין חומצות אמינו שיכולות להיות מרוחקות זו מזו , כדי שהדבר יקרה נדרשת התקפלות של הפפטיד כך שאזורים מרוחקים יתקרבו זה לזה ושיירי הצד שלהם ייצרו אינטראקציות , הקיפול הזה מתרחש הודות ל 4 חומצות אמינו: **פרולין , גליצין , תריאונין וסרין** שהמיקום שלהם ומספרם קובע את צורת הקיפול.
מבנה שניוני הוא גם כן מרחבי , אך אנטראקציות המימן שמייצבות אותו הן של שיירי חומצות אמינו סמוכות
96
מבנה רביעוני:
עד המבנה השלישוני בעצם מדובר בהיררכיות מבניות שונות של **אותה שרשרת** פוליפפטידית. מבנה רביעוני מתייחס כבר למספר שרשראות פפטידית שונות שנקשרות יחדיו. כל שרשרת פוליפפטידית היא **תת יחידה**
**אוליגמר:** מבנה רביעוני של חלבון שלפחות שתיים מתת היחידות שמרכיבות אותו הן זהות , יחידות זהות אלה נקראות פרוטומרים protomers
המוגלובין הוא טטראמר של ארבע יחדות שתיים אלפא ושתיים בטא , או דימר של שני פרוטומרים.
אם תת היחידות שמרכיבות מבנה רביעוני קשורות בצורה לא קוולנטית , אז הם נקראות ״תת יחידות״ (המוגלובין) , ואם הם קשורים באופן קוולנטי אז הם נקראות שרשראות.
97
כמה יחידות מכיל:
דימר פרוטומרי
מונומר פרוטומרי
טרימר פרוטומרי
טרימר
הומוטרימר
1) דימר פרוטומרי: ארבע תת יחידות , כל שתיים זהות.
2) מונומר פרוטומרי: שתי תת יחידות זהות
3) טרימר פרוטומרי: 6 תת יחידות , כל שתיים זהות
4) טרימר: 3 תת יחידות שונות
5) הומוטרימר: 3 תת יחידות זהות
האם קלתרין הוא טרימר פרוטומרי ?
98
חחבונים סיביים לעומת גלובולריים:
**סיביים:** לרוב יהיו מורכבים מסוג **יחיד** של מבנה שניוני , והם בעלי מבנה שלישוני פשוט (שהוא בדרך כלל המבנה השניוני שחוזר על עצמו מספר פעמים). חלבונים אלה לרוב יהוו חלבונים מבניים ויקנו קשיחות / גמישות לרקמה בה הם נמצאים.
**גלובולריים:** מכילים מספר סוגים של מבנים שניוניים , אנזימים וחלבונים רגולטוריים הם לרוב גלובולריים
99
אלפא קרטין , קולגן ופיברואין של משי:
דוגמאות לחלבונים סיביים בעלי תפקיד מבני
100
תכונה משותפת לכל החלבונים הסיביים:
**הם כולם אינם מסיסים במים** , הודות לריבוי חומצות אמינו הידרופוביות במבנה שלהם
שקף 86
101
מבנה של אלפא קרטין:
שקף 87
בפרוטופילמנט הקצה האמיני של אחד הסיבים ממוקם ליד הקצה הקרבוקסילי של הסיב השני (שקף 89)
לזכור שחלבונים סיביים חולקים תכונות מבניות משותפות רבות , אלפא קרטין מדגים חלק מהם , כגון הידרופוביות , או למשל קשרי צילוב שמקנים חוזק ועמידות לרקמה , באלפא קרטין קשרי הצילוב הם ספיציפית SS
102
תכונות של אלפא קרטין:
1) קיים אך ורק ביונקים ויוצר מגוון רחב של מבנים. אלפא קרטין הוא המרכיב הכמעט בלעדי בשיער , קרניים , ציפורניים , וכן מרכיב של השכבה החיצונית של העור
2) מקנה **חוזק ועמידות** לרקמה שהוא נמצא בה
**3) שייך למשפחת **סיבי הביניים** , שחברים בה הם חלק משלד התא (למינים)**
4) חלבוני קרטין מיוצבים ע״י קשרי SS , ולכן נמצא המון צסטאינים במבנה שלהם. ככל שיש יותר צסטאינים , ועל כן יותר קשרי SS , המבנה יהיה יותר קשיח , כמו למשל קרן של קרנף
5) הסיב מכיל המון חומצות אמינו הידרופוביות , בעיקר אליפטיות ,
103
יחידת המבנה הבסיסית ביותר של אלפא קרטין היא:
סליל אלפא ימני
104
מבנה הקולגן:
היחידה המבנית הבסיסית של סיב הקולגן היא **סליל בעל סיבוב שמאלי** , שנקרא α chain או α קולגן. ה α chain עצמו בנוי מיחידות חוזרניות של Gly-X-Pro או Gly-X-4Hyp למשל:
GlyXPro-GlyXPro-GlyXPro = α chain
כל α chain הוא באורך של כ 1000 חומצות אמינו , סיבוב אחד של ה α chain מכיל 3 חומצות אמינו.
שלשה α chains מתלפפים יחדיו **בצורה ימנית** ליצירת collagen superhelix , יתכן שכל אחד מבין השלשה יהיה מורכב מרצפים שונים של ח״א
הגליצין שוכן בתוך הליבה של הסופרהליקס , ולו תפקיד חשוב , הוא נמצא בצמתים בהם שלשת הסלילים מתחברים.
שקף 93
105
תאר את מימדיו של סיב הקולגן:
הוא מורכב מ 3 α chains בסיבוב ימני:
- עובי: 15 אנגסטרום
- אורך: 3000 אנגסטרום
106
תפקיד סיב הקולגן:
תפקידו הוא להקנות כח וקשיחות לרקמה ,
קיימים סוגים רבים של קולגן **כ 30 וריאנטים ביונקים** , והם נמצא בגידים , סחוס , המטריצה של העצם ועוד.
**קולגן הוא החלבון הנפוץ ביותר בגוף האדם** , שכיחות חומצות האמינו שבו:
- גליצין 35%
- פרולין 21%
- 4 הידרוקסי פרולין 33%
- אלאנין 11%
תפקיד הגליצין: לאפשר היצמדות של שלשת סיבי ה α chains
תפקיד הפרולין וה 4 הידרוקסי פרולין: לאפשר את הפיתולים החדים שקיימים במבנה הקולגן סופרקויל
107
השוואה בין סליל אלפא רגיל ל α קולגן: (α chain)
בסליל אלפא רגיל , הסיבוב הוא ימני , ובכל סיבוב שלם יש 3.6 חומצות אמינו. זווית הפיתול שלו היא 100 מעלות
בסליל α קולגן , הסיבוב הוא שמאלי , ובכל סיבוב שלם יש 3 חומצות אמינו. זווית הפיתול שלו היא 120 מעלות
108
כלל מבני חשוב בחלבונים סיביים:
כאשר יחידות המבנה הבסיסיות מתלפפות זו סביב זו ליצירת רמה מבנית גבוהה יותר , הסיבוב שהם יוצרים יהיה הופכי מהסיבוב של היחידה עצמה:
- **אלפא קרטין:** יחידת הבסיס היא סליל אלפא **ימני** , שניים כאלה מתלפפים זה על זה ליצירת two chain coild coil **שמאלי**.
- **קולגן**: יחידת הבסיס , α chain , היא בעלת סיבוב **שמאלי** , שלש כאלה מתחברים ליצירת collagen supercoil בעל סיבוב **ימני**.
109
קשרי צילוב בקולגן:
אמרנו שמוטיב חוזר בחלבונים סיביים הוא קשרים צולבים , שמקנים להם קשיחות. ראינו באלפא קרטין למשל שקשרי הצילוב הם קשרים תיולים דיסולפידיים SS שנוצרים ע״י ציסטאינים
בקולגן קיימים קשרי צילוב שנוצרים ע״י חומצות האמינו הבאות:
- ליזין
- 5 הידרוקסי ליזין
- היסטדין
110
מחלות הקשורות בקולגן פגום:
1) **osteogenesis imperfecta:**
מחלה בתינוקות , שבעקבות פגם במבנה הקולגן של המטריצה של העצם , נוצרות עצמות פגומות , קיימים 8 מופעים שונים של המחלה
2) **תסמונת Ehlers Danlos:** מאופיינת ע״י מפרקים רופפים. קיימים 6 מופעים של המחלה
שתי המחלות יכולות להיות **קטלניות** , ושתיהן נגרמות עקב החלפת הגליצין שברצף Gly-X-Pro/4Hyp **בחומצת אמינו גדולה יותר** , הגליצין כאמור הכרחית להיצמדות שלשת ה α chains יחדיו ליצירת סיב הקולגן סופרקויל , ואם היא נעדרת , המבנה נפגע בצורה הרת אסון.
כתלות במיקום הגליצין שמוסר , יהיה למחלות מופע שונה
111
צפדינה:
Scurvy
נגרמת עקב מחסור בויטמין C שחיוני להידרוקסילציה של פרולין וליזין (יצירת 4 הידרוקסי פרולין ו 5 הידרוקסי ליזין) שחיוניים להיווצרות מבנה קולגן תקין.
מדובר בניוון כללי של רקמת החיבור , פגיעה ב integrity של כל״ד ודימום ואי ספיקת לב
בני אדם אינם מסוגלים לייצר ויטמין c בעצמם ולכן הוא נדרש בתזונה
112
משי:
משי הוא חלבון מבני
משי וקורי עכביש עשויים בעיקר מחלבון בשם **פיברוין fibroin** שבנוי ממשטחי בטא **אנטי פרלליים** , העשירים בשתי חומצות האמינו **גליצין ואלנין** , אלו הם שתי חומצות אמינו קטנות , מה שמאפשר **מבנה דחוס** של החלבון.
המבנה של החלבון מאופיין בכך שהוא ממקסם את פוטנציאל קשרי **ון דר ולס** בין המשטחים , לצד קשרי המימן כמובן בין שיירי חומצות האמינו
בין משטחי הבטא שמרכיבים את חלבון הפיברוין שמרכיב את סיב המשי , **אין קשרים צולבים** ולכן החלבון הוא גמיש למדי. אך הוא לא יכול להימתח בגלל **שמבנה שניוני מסוג משטח בטא הוא בעצם מבנה שניוני פתוח , כלומר כבר נמצא ברמה הכי פתוחה / מתוחה שלו**.
113
חלבונים גלובולריים:
- יותר קומפקטיים ודחוסים מחלבונים סיביים
- בגלל אפשרויות קיפול רבות ושונות הם יותר מגוונים מחלבונים סיביים (מבנה ותפקיד)
שקף 107: מובאת דוגמה לקומפקטיות של חלבונים גלובולריים , המבנה של החלבון אלבומין , **שמורכב מ 585 חומצות אמינו** , במצבים פרוסים (אלפא הליקס בטא שיט) הוא ארוך הרבה יותר ממצבו המקופל והגלובולרי.
114
מיוגלובין:
חלבון גלובולרי קטן , מכיל שרשרת פוליפפטידית אחת שמורכבת מ 153 חומצות אמינו
בחלבון יש קבוצה פרוסטטית שנקראת פרוטופורפרין או protoporphyrin , במרכזה יש אטום ברזל (קבוצת heme) , שמשמש לקשירת חמצן
החלבון ללא קבוצת ה heme נקרא apomyoglobin
קבוצה פרוסטטית דומה נמצאת גם בהמוגלובין , ובכללי בהמופרוטאינים.
מיוגלובין מורכב משרשרת פפטידית אחת , ולכן בניגוד להמוגלובין , אין לו מבנה רביעוני.
115
פרוטופורפרין
Protoporphyrin
קבוצה אורגנית **מישורית** , מהווה חלק אינטגרלי ממבנה של חלבונים שאינה חומצה אמינית , ועל כן נחשבת קבוצה פרוסטטית. פרוטופורפרין יכול לקשור אטום מתכת כלשהו , במידה והאטום הזה הוא ברזל הקבוצה תקרא heme.
פרוטופורפרין הוא חבר במשפחת הפורפרינים , פורפרין זה שם כולל של מולקולות הבנויות משש טבעות פירוליות pyrrole הקשורות בינהם בקשר methene
מבנה כזה קיים בהמוגלובין , מיוגלובין , ציטוכרום c
116
קבוצת heme:
קבוצה פרוסטטית שנמצאת במשפחת חלבוני ההמופרוטאינים (ועל כן שמם) , מדובר בטבעת פרוטופורפרין שבמרכזה אטום ברזל במצב מחוזר (ופעיל) ferrous בעל מטען +2
אטום הברזל במרכז טבעת הפרוטופורפרין מסוגל ליצר 6 קשרים קאורדינטיביים:
- 4 מישוריים (במישור של הפרוטופורפרין וקשורים אליה באטום חנקן)
- 2 מאונכים לפרוטופורפרין
בהמוגלובין ומיוגלובין , אחד מהקשרים המאונכים קשור לאטום חנקן שבשייר הצד של החומצה האמינית הסטדין (כחלק ממבנה החלבון) היא נקראת **ההסטדין הפרוקסימלי**. הקשר המאונך השני זמין לקשירת מולקולת חמצן O2
שקף 110
117
Ferrous:
המצב **המחוזר** והפעיל של ברזל , בעל מטען של 2+
המצב **המחומצן** והלא פעיל של אטום הברזל הוא בעל מטען 3+ , נקרא ferric
118
דומיינים ומוטיבים:
מוטיב-
מוטיב: מתייחסים אליו כאל **מבנה על שניוני**. בעצם מדובר בתבנית קיפול מיוחדת (קבועה) המערבת **שני אלמנטים או יותר** של מבנים שניוניים המחוברים בינהם. אין הדבר אומר שזוהי רמה מבנית נוספת בין מבנה שניוני לשלישוני , אלא פשוט דפוס קיפול.
מוטיב יכול להיות פשוט ויכול להיות מורכב: מוטיב פשוט הוא כזה שמכיל אלמנטים שניוניים מעטים שמהווים רק חלק מהחלבון השלם , למשל המוטיב β-α-β loop הוא דוגמה למוטיב פשוט.
מוטיב משוכלל הוא כזה שמורכב מעשרות מקטעים המחוברים זה לזה כגון **חווית בטא** , במקרים מסויימים מוטיב משוכלל יכול להוות את כל החלבון.
המוטיב coild coil של אלפא קרטין הוא מוטיב משוכלל כי מהווה את כל החלבון
המוטיב globin fold הוא מוטיב שבנוי מ 8 סליחי אלפא , ונמצא אותו בכל משפחת הגלובינים.
מוטיב נוסף הוא histone fold ומורכב מ helix-loop-helix-loop-helix
119
דומיינים ומוטיבים:
דומיין-
דומיין הוא מונח שמתקשר למבנה שלישוני של חלבונים (להבדיל ממוטיב שמתאר מבנה שניוני)
דומיין הוא אזור בחלבון **בעל יציבות עצמאית** , כלומר מסוגל לעשות תנועה כיחידה אחת באופן נפרד מהחלבון הכולל.
דומיין הוא בעל תפקיד מוגדר (למשל קטליטי) , שבמקרים רבים ניתן אף לבודד אותו מהמבנה השלם של החלבון והוא עדיין ימשיך לתפקד , כלומר ישמור על מבנה נאטיבי באופן עצמאי.
פוליפפטידים גדולים (כמה מאות חומצות אמינו ברצף הראשוני) מתקפלים בד״כ לשני דומיינים או יותר , בחלק מהמקרים ניתן להבדיל (מבנית) בין הדומיינים השונים , אך **יותר נפוץ שלא מבדילים** בגלל מגע הדוק בינם.
פוליפפטידים קטנים מתקפלים בד״כ לדומיין יחיד , שהוא החלבון עצמו.
120
ההבדל בין מוטיב לדומיין:
1) מוטיב: אלמנט מבני של חלבונים , מבחינה היררכית מדובר במבנה שניוני , אינו יכול להתקיים לבד ואינו בעל יציבות עצמאית יחסית לשאר החלבון
2) דומיין: אלמנט מבני/תפקודי של חלבונים , מבחינה היררכית שייך לרמה שלישונית , יכול להתקיים לבד ובעל יציבות עצמאית יחסית לשאר החלבון
121
חלבונים שאינם מסודרים:
Intrinsically disordered
אלה חלבונים שבאופן טבעי אינם סדורים , ולא כתוצאה מפגיעה במבנה שלהם
דוגמה לכך הוא החלבון p53 , שמורכב מכמה סגמנטים , כשרק הדומיין האמצעי שלו מסודר , ושני הקצוות שלו , ה N טרמינל וה C טרמינל , אינם מסודרים באופן טבעי.
ניתן לזהות מקטעים לא מסודרים במבנה של חלבון לפי תוכנת PONDR , שמנבאת האם חומצת אמינו נתונה תהיה באזור לא מסודר של חלבון. תוצאה של 1 ב pondr אומרת שהסיכוי בוא 100% שחומצת האמינו תהיה ממוקמת באזור לא מסודר של החלבון.
122
מדוע לא ניתן לקבוע את המבנה של כל החלבונים ?
אם נדון בקריסטלוגרפיה , שהיא שיטה שלומדים דרכה על מבנה החלבון , לעיתים לא ניתן לגבש את החלבון ולהסיק על מבנהו , מכמה סיבות אפשריות:
- חלבונים מסויימים מכילים מקטעים שעד כדי כך אינם סדורים וחסרי ארגון כשנמצאים במבנה גבישי , כך שבקריסטלוגרפיה המבנה המתקבל אינו כולל את המקטעים האלה , מה שאומר שהתוצאה אינה נאמנה למקור
- החלבון מטבעו מכיל אזורים שאינם סדורים ואינם מאורגנים
כשליש מהחלבונים האנושיים נופלים תחת אחת משתי הסיבות הנ״ל , משמע כשליש מחלבוני בני האדם אנחנו לא באמת יודעים מה המבנה האמיתי שלהם
123
תכונות חלבונים לא מסודרים:
Intrinsically disordered
1) אינו מכיל ליבה הדרופובית , אלא במקום מכיל רצפים רבים של חומצות אמינו טעונות כגון ארגנין וליזין וגלוטמאט
2) מכיל המון פרולין , חומצה אמינית זו בגלל השייר הטבעתי שלה וחוסר יכולתה ליצר קשרי מימן , מפרה מבנה שניוני סדור של חלבונים , כך שהגיוני למצוא אותה בקטגוריה זו של חלבונים
3) קשים לגיבוש (קריסטלוגרפיה) בגלל המבנה הגמיש שלהם
124
למה משמשים חלבונים לא מסודרים ?
Intrinsically disordered
1) הם משמשים כספייסרים / לינקרים / אינסולטורים בין מבנים מולקולריים גדולים
2) ״פחי אשפה״ של התא , אליהם נספחים ונקשרים כל מיני יונים ומולקולות קטנות בתמיסה
3) חלבוני בקרה **אינהיביטוריים:** הם **נקשרים** לחלבונים מסויימים ועוטפים אותם , ובכך מעכבים את פעילותם.
בגלל הטבע הלא מסודר שלהם , חלבונים אלו הם בעלי ״פלואידיות״ תפקודית גבוהה , משמע , הם אינם מוגבלים למבנה כזה או אחר , כך שחלבון אחד כזה יכול לקשור עשרות סוגים של מולקולות.
125
דוגמאות לחלבונים לא מסודרים:
1) החלבון p27 בעל התפקיד הרגולטורי בחלוקת התא **היונקי**. החלבון מעכב את הפעילות של מספר קינאזות , ובכך מונע שגשוג תאים וממאירות. רמות נמוכות שלו בחולי סרטן מעידים על מחלה מתקדמת.
2) החלבון p53 שגם כן מבקר חלוקה תאית. שני הקצוות של החלבון , האמיני והקרבוקסילי אינם מסודרים , בעוד הסגמנט האמצעי שלו כן. הקצה הקרבוקסילי שלו יוצר אינטראקציה עם יותר מ 4 חלבונים שונים , ויוצר מבנה אחר בכל אחד מהקומפלקסים הנוצרים.
126
היכן סביר למצוא פרולין:
פרולין אינה שכיחה בחלבונים בגלל התכונות המבניות שלה שפוגעים ביכולת הקיפול התקינה שלהם. יחד עם זאת , ניתן למצוא אותה במספר מבנים חלבוניים מיוחדים:
1) סיבובי בטא β turn מסוג 1 , בהם הוא שכיח בעמדה מס׳ 2
2) בשלשה החוזרנית Gly-X-Pro במבנה של α chain שבונה קולגן
3) בחלבונים לא מסודרים
127
פרוטאוסטזיס:
הומיאוסטזיס של חלבונים
פרוטאוסטזיס מתייחס למסלולי הסנתזה , קיפול , **קיפול מחדש** ודגרדציה של כל החלבונים בתא וכן למערכות התאיות הרבות שמשתתפות בתהליכים הנ״ל כגון פרוטאוזומים וריבוזומים. תפקיד הפרוטאוסטזיס הוא לשמור על כמות חלבונים תקינה שחיונית לתפקוד נאות של התא
בחלבונים קיים חוסר יציבות טבעי (כזכור חלבון מעדיף לא להתקפל) , בפועל בתא , חייו של החלבון הרבה יותר מורכבים מסנתזה ודגרדציה , אלא שבמהלך חייו חלבון יכול להיפתח ולחזור להתקפל מספר פעמים , קיים איזשהו איזון בתא ששומר על רמת חלבונים מקופלים תקינה.
128
מדוע פרוטאוסטזיס כה חשוב ?
כי חלק מהמנגנון הוא קיפול חוזר של חלבונים שנפתחו או שמלכתחיחה לא התקפלו נכון , או לחילופין דגרדציה שלהם והשמדתם.
לחלבונים שאינם מקופלים יש לעיתים קרובות פני שטח הידרופוביים שפונים למדיום המימי , ולכן אזורים אלו נוטים להידבק ולהיקשר לאזורים דומים בחלבונים אחרים וליצור אגרגטים - צבר חלבונים לא פעילים - ששוקע בתא וגורם למחלות רבות.
הגוף יכול להתמודד עם התופעה עד רמה מסויימת , אולם הצטברות חלבונים כאלה שיוצרים משקעים לבסוף תגרום למחלות כגון סוכרת , אלצהיימר ופרקינסון.
ועל כן חשיבות מנגנוני הפרוטאוסטזיס
129
שפרונים:
חלק ממערך הפרוטאוסטזיס התאי
חלק מהחלבונים שמסונתזים בריבוזים יכולים להתקפל לקונפורמציה הנאטיבית שלהם באופן ספונטני , אולם **רוב החלבונים דורשים סיוע של שפרונים כדי להתקפל נכון**
לשפרונים מספר תפקידים , חלקם מסייעים לחלבון להתקפל מחדש אחרי שהוא נפתח , וחלקם משנעים חלבונים ממקום למקום. השפרון יודע לזהות את אותם אזורים הידרופוביים בחלבון הלא מקופל ולהיקשר אליהם.
130
הגדר דה נטורציה:
אובדן המבנה **התלת מימדי** של החלבון , כאשר הקיפול שלו נהרס כליל או באופן חלקי , מה שמוביל לפגיעה בתפקודו.
דה נטורציה היא שינוי **בקונפורמציה** של החלבון!
131
גורמים לדה נטורציה:
1) **חום:** ע״י פגיעה בקשרים חלשים , בעיקר מימן
2) **רמת ה pH:** חומצות אמינו יכולות לעבור פרוטונציה או דה פרוטונציה כתלות בערך ה pH של התמיסה , מה שיוצר הנם מטען / מעלים מהם מטען , וזה עלול לגרום לדחיה וערעור במבנה החלבון.
3) **ממסים אורגניים:** אלכוהול , אצטון , דטרגנטים , אוריאה , גוואנידין הידרוכלוריד. נראה לי ממסים אלה מתחרים עם חומצות האמינו בחלבון על הקשרים הבין מולקולריים שמחזיקים אותם יחדיו (ואת מבנה החלבון) , ובכך מערערים את מבנה החלבון התלת מימדי.
דטרגנטים: מתחרים על קשרים הידרופוביים
אוריאה: הידרופוביים וקשרי מימן
שאלה 53 מבחן ביוכימיה 2
132
חום כגורם לדה נטורציה:
רוב החלבונים רגישים לחום ויכולים לעבור דה נטורציה כשנחשפים לטמפרטוטורות גבוהות.
חום פוגע באינטראקציות בין מולקולריות שמייצבות את מבנה החלבון , **בייחוד קשרי מימן**.
חשיפה לחום מלמדת **שאובדן המבנה הנאטיבי של חלבונים הוא תהליך קאופרטיבי מתואם** , משמע , איבוד המבנה בחלק אחד של החלבון מערער את יציבות שאר החלקים.
133
דה נטורציה הינה תהליך קאופרטיבי:
זאת ניתן ללמוד מחשיפת חלבונים לטמפ׳ גבוהה!
אם עושים את התהליך בהדרגה , ומעלים את החום באיטיות , נראה שהקונפורמציה של החלבון בד״כ לא תפגע עד שמגיעים לסף טמפ׳ מסויים שבו נראה לפתע איבוד פתאומי של המבנה והתפקוד של כל החלבון , **שיתרחש בטווח צר של טמפ׳** משהגענו לטמפ׳ סף.
הסיבה לכך היא שהחלבון מצליח להחזיק את מבנהו עד שמגיעים לטמפ׳ הסף. ברגע שהגענו לטמפ׳ הסף , מספיק שאזור אחד בחלבון יתפרק , הדבר מערער את שאר האזורים בחלבון , וכך כל החלבון מתפרק , ועל כן קאופרטיביות.
מנגד , אם נחשוף את החלבון בבת אחת לטמפ׳ גבוהה (טמפ׳ על סיפית) נראה שהדה נטורציה מתרחשת באופן מיידי , כי יש בה די כדי לערער לפחות אזור אחד בחלבון , וזה כבר גורם לאפקט ״כדור השלג״ של הקאורפרטיביות.
**הואיל ומדובר בתהליך קואופרטיבי , הגרף המתאר דה נטורציה של חלבונים יהיה סיגמואידלי**.
שקף 124
134
דה נטורציה וקשרים קוולנטיים:
**דה נטורציה מתייחסת להרס המבנה המרחבי של חלבון** ואובדן תפקודיות. אין התייחסות לסוג הקשר שנפגע בעת התהליך , אלו יכולים להיות קשרים חלשים שנפגעים , וכן קשרים קוולנטיים כגון גשרים דיסולפידיים.
ההבדל נקבע לפי הגורם לדה נטורציה , גורמים מסויימים כגון חום או אוריאה יכולים לגרום לדה נטורציה מבלי לפגוע בקשרים די סולפידיים , גורמים מחזרים מנגד , כמו מרקפטואתנול , יכולים לגרום לדה נטורציה שפוגעת בקשרים די סולפידיים ע״י חיזורם.
135
טמפרטורת התכה:
Melting temperature , Tm
**הגדרה1:** נקודת אמצע טווח הטמפרטורות בו מתרחשת דה נטורציה.
אם נתון שדה נטורציה של חלבון מתרחשת בין הטמפרטורות 39 - 42 , אז ה Tm יהיה 40.5
**הגדרה2:** טמפרטורת ההתכה שבה 50% מהחלבון איבד את המבנה המרחבי שלו.
136
רה נטורציה:
התהליך המתרחש בחלבון שעבר דה נטורציה ברגע שהוסרו הגורמים הדה נטורטיביים , והחלבון חוזר לקיפול נאטיבי.
התהליך כמובן אינו מתרחש בכל חלבון שעבר דה נטורציה , יש כאלה שכן ויש כאלה שלא.
בתוך החלבונים שעוברים רה נטורציה , חלקם יעברו רה נטורציה ספונטנית **בעיקר חלבונים קטנים ובעלי יציבות טבעית** , אולם **רוב החלבונים** יצטרכו סיוע (של שפרונים).
137
דה נטורציה ורה נטורציה של ריבונוקליאז A:
ריבונוקליאז A הינו חחבון שמבנהו השלישוני מיוצב הן ע״י קשרים בין מוחקולריים , והן ע״י קשרים די סולפידיים , למעשה החלבון מכיל **4 קשרים די סולפידיים במבנה שלו**.
הוא יכול לעבור דה נטורציה רק ע״י שבירת הקשרים הבין מולקולריים (ע״י אוריאה למשל שמערערת קשרים הידרופוביים) , וכן הוא יכול לעבור דה נטורציה ע״י שבירת הקשרים הדיסולפידיים (חיזורם ע״י מרקפטואתנול)
החלבון מסוגל לעבור רה נטורציה ברגע שמסלקים את הגורמים לדה נטורציה , בשני המקרים **הרה נטורציה הינה ספונטנית** , והחלבון חוזר למבנה תקין , ולפעילות קטליטית מלאה.
138
מה קובע אם חלבון יתקפל באופן ספונטני או שמא בסיוע (של שפרונים) ?
המידע נמצא ברצף הראשוני של החלבון , כלומר רצף חומצות האמינו בשרשרת הפפטידית מכיל את כל המידע הנחוץ כדי שחלבון יתקפל למבנהו הנאטיבי. לרבות צורת קיפול , והאם היא מתרחשת באופן ספונטני או בסיוע.
139
שפרוני HSP70:
הסבר לגבי השם:
**heat shock proteins**
אלה הם שפרונים שהריכוז שלהם בתא עולה כאשר יש עקת חום - הגיוני בסך הכל , חום הינו גורם דה נטורטיבי שפוגע במבנה של חלבונים ופותח אותם , בתגובה ריכוזי חלבוני hsp70 עולה כדי לסייע בקיפול חוזר של החלבונים הפגועים וכן במניעת היווצרות אגרגטים.
לגבי 70 , זהו המשקל המולקולרי של החלבון 70000 דלטון
שפרוני hsp70 קושרים פוליפפטידים באזורים הידרופוביים , תפקידם אינו מוגבל רק למצבי סטרס שנגרמו עקב חום , שפרוני hsp70 נקשרים לפוליפפטידים חדשים שזה עתה סונתזו ושומרים עליהם שלא יתקפלו (טרנסלוקציה למיטוכונדריה) וכן מונעים היווצרות אגרגטים. **פעולה נוספת ש hsp70 יודע לעשות זה לקשור צבר של חלבונים לא מקופלים ולפרק אותו**
שפרונים מסויימים מסייעים ביצירת מבנים רביעונים של חלבונים.
140
תכונות של שפרונים:
שפרונים היא משפחה של חלבונים , הם חלק ממנגנון הפרוטאוסטזיס של התא , חברים שונים במשפחה עובדים יחדיו ודואגים לשמור על מאזן תקין של חלבונים לא מקופלים לעומת מקופלים , וכן מונעים היווצרות אגרגטים.
כל חברי המשפחה הם ATPases , ומפרקים אטפ לצורך עבודתם.
141
hsp70 + hsp40:
כאמור שפרונים היא משפחה , חברים שונים עובדים יחדיו זה עם זה.
**שני השפרונים הנ״ל ספיציפית לא לוקחים חלק פעיל בקיפול חלבונים , תפקידם הוא להיקשר לחלבונים לא מקופלים (או מקופלים חלקית) ולמנוע את ההתקבצות והשקיעה שלהם**
1) שפרון hsp70 במצב **פתוח וקושר אטפ** נקשר לחלבון לא מקופל באפיניות נמוכה
<=
2) מגיע hsp40 ונקשר לקומפלקס
<=
3) הקישור של hsp40 גורם ל hsp70 לבקע את האטפ , מה שגורם לו להיסגר , אדפ נשאר קשור , פוספט משתחרר.
**כעת המצב הוא שיש לנו קומפלקס סגור של hsp70-hsp40-חלבון-אדפ**
4) מחזור של ה hsp70 מתרחש כאשר NEF נקשר לקומפלקס nucleitide ecxchange factor , ה NEF נקשר לקומפלקס , מנתק את ה hsp40 , את החלבון הלא מקופל , גורם לאדפ להשתחרר , מחליפו באטפ , וה hsp70 חוזר למצבו הפתוח ומוכן לקלוט חלבון נוסף.
142
כיצד ממוחזר שפרון hsp70 ?
ע״י קישור לחלבון NEF
nucleotide exchange factor
קישור של NEF גורם למספר דברים:
- שחרור החלבון הלא מקופל
- שחרור hsp40
- שחרור האדפ והחלפתו באטפ
כל זה מחזיר את hsp70 למצב שהוא יכול לקלוט חלבון נוסף , **פתוח וקושר אטפ**.
143
מה עולה בגורלו של חלבון לא מקופל / מקופל חלקית אחרי שקשר קומפלקס
hsp70-hsp40 ?
1) אז עבור חלבונים **מקופלים חלקית** , אחרי שהם משתחררים מקומפלקס השפרונים , חלקם יתקפלו מעצמם לצורתם הנאטיבית , בעצם השפרונים שומרים עחיהם מפני אגרגציה , ואז כשהם משתחררים הם יכולים להתקפל
2) חלקם האחר לא מצליחים להתקפל ולכן נקשרים בשנית ע״י השפרונים , כדי למנוע אגרגציה שלהם ולתת להם הזדמנות שניה להתקפל.
3) חלקם מועברים למערכת השפרונין (hsp60)
144
האם קיימים שפרונים גם בחיידקים ?
כן ,
שפרונים קיימים במגוון רחב של אורגניזמים , מחיידקים ועד יונקים. עבור שני השפרונים היוקריוטיים hsp70 ו- hsp40 קיימים שני אנאלוגים חיידקיים:
hsp70 = DnaK בחיידקים
hsp40 = DnaJ בחיידקים
145
במה שונה hsp70 פתוח מ hsp70 סגור ?
במצבו הפתוח:
- קושר אטפ
- אפיניות ירודה כלפי רצפים הידרופוביים
במצב סגור:
- קושר אדפ
- אפיניות גבוהה כלפי רצפים הידרופוביים
מכאן ניתן לראות שהשפרון קושר יותר טוב את החלבון שלו כשהוא סגור וחלק מהקומפלקס hsp70-hsp40
146
שפרונין:
מדובר למעשה **בשפרון hsp60** ,
מדובר בקומפלקס חלבוני מורכב , שתפקידו הוא **לקפל באופן פעיל** חלבונים שלא מסוגלים להתקפל ספונטנית.
ז״א בניגוד ל hsp70 ו- hsp40 שתפקידם בגדול להיקשר לחלבונים לא מקופלים ולמנוע אגרגציה , ה hsp60 הוא הוא מכונת הקיפול.
קיימת בחיידקים מערכת אנאלוגית ל hsp60 הנקראת GroEL/GroES
147
האם שפרוני hsp פעילים בתא רק בעת מכת חום ?
לא , הם פעילים גם בתנאים רגילים!!
**אולם בעקת חום ריכוזם בתא עולה**
נמצא כי באי קולי בין 10% ל 15% מהחלבונים דורשים סיוע בקיפול בתנאים רגילים , אולם במצב של מכת חום , המספר הזה עולה ל 30%. הדבר מסביר מדוע נדרש ריכוז יותר גבוה של חחבוני hsp במצבים של עקת חום
148
מה קורה כאשר hsp60 קושר אטפ לעומת hsp70 ?
hsp70 + ATP = open
hsp60 + ATP = closed
149
שפרונים בפרוקריוטים:
השפרונים התגלו לראשונה בפרוקריוטים , נמצא כי שני השפרונים החיידקיים DnaK ו DnaJ קשורים לשכפול גנום ויראלי (ומכאן השם Dna)
בעוד השפרונינים GroEL/GroES נמצאו כנחוצים עבור גדילה של וירוסים מסויימים , (ומכאן השם Gro - גדילה).
150
מבנה השפרונין GroEL/GroES:
ה GroEL הוא בעצם השפרונין עצמו , הוא שייך למשפחת חלבוני hsp60 , והוא מורכב משני chambers המדמים שתי חביות המוצמדות זו לזו בתחתית שלהם (שקף 136). **כל צ׳מבר בפני עצמו** הוא בעל משקל מולקולרי של 57000 דלטון.
לכל חבית יש מכסה , ה GroES הוא המכסה , ומשקלו 10000 דלטון.
כל צ׳מבר של GroEL הוא הפטמר , גם המכסה (GroES) הוא הפטאמרי , כלומר מורכבים מ 7 תת יחידות.
שני הצ׳מברים של GroEL לא מסוגלים לפעול בו זמנית , כאשר אחד פעיל , השני בהכרח לא פועל.
151
אופן פעולת השפרונין GroEL/GroES:
**1)** שפרון GroEL שוחה לו בציטופלסמה **כשהוא במצב פתוח**
**2)** מגיע hsp70 ומוסר אליו חלבון קליינט לא מקופל , החלבון הלא מקופל נקשר דרך האזורים ההדרופוביים שלו לאזורים הידרופוביים שנמצאים בפתח הצ׳מבר של GroEL (נקרא apical end)
**3)** כעת מגיעות 7 מולקולות אטפ ונקשרות אליו
**4)** קישור האטפ גורם לשינוי מבני ב GroEL , מה שמאפשר קישור של GroES.
**5)** 7 מולקולות האטפ שקשורות אליו מבוקעות , ונפלטים לציטופלסמה 7 פוספטים. האדפ + GroES נותרים קשורים. כעת נכנס חלבון לצ׳מבר השני + מגיעות 7 מולקולות אטפ ונקשרות אליו , הדבר גורם לדיסוציאציה של GroES ולשחרור האדפ וכן ליציאת החלבון הקליינט
וחוזר חלילה.
ל GroEL יש שני צ׳מברים שלא פעילים בו״ז , הצ׳מבר שבתוכו נמצא החלבון יקרא **ציס** , הצ׳מבר הריק נקרא **טרנס**.
שקף 135
152
כמה זמן שוהה חלבון לא מקופל בתוך שפרונין ?
כ 10 שניות.
זהו למעשה הזמן שלוקח ל GroEL לבקע את 7 מולקולות האטפ הקשורות אליו.
**במונחים מולקולריים , זה נחשב הידרוליזה איטית של אטפ.** כליאת החלבון הקליינט בתוך הצ׳מבר מצמצמת את מרחב הקונפורמציות שהשרשרת הפפטידית של הקליינט יכולה לקבל , וכך ״כופה״ על החלבון קיפול נכון.
153
מה מניע קישור ושחרור של GroES ?
בעצם שינויי קונפורמציה של GroEL , הנגרמים מקישור וביקוע האטפ.
154
קיפול תקין של חלבונים מסויימים דורש לעיתים תגובות **איזומיריזציה**:
בתוך כך אנחנו דני בשני חלבונים:
- PDI: protein disulfude isomerase
- PPI: peptidyl prolyl isomerase
תפקיד ה PDI הוא לעשות shuffling של קשרים דיסולפידיים בתוך החלבון עד לקבלת המבנה הנאטיבי.
תפקיד ה PPI הוא לזרז המרה בין איזומירי ציס וטרנס של הקשר הפפטידי , סביב חומצה אמינית מסוג פרולין.
155
תאר את תפקיד החלבון PDI:
תפקיד ה PDI הוא לעשות shuffling של קשרים דיסולפידיים בתוך החלבון עד לקבלת המבנה הנאטיבי. בעת שחלבון המכיל שיירי ציסטאין מתקפל , קבוצות ה R של הצסטאינים מייצרים קשרים דיסולפידיים בינם לבין עצמם , לעיתים הקשרים שנוצרים הם לא לפי הקיפול הנאטיבי הדרוש לחלבון , תפקיד PDI הוא לשבור אותם ולחבר אותם שוב ושוב עד לקבלת הקשרים הנכונים , שמייצבים את המבנה הנאטיבי.
156
תאר את תפקיד החלבון PPI:
פרולין נמצאת בקונפיגורציית ציס ב 6% מהקשרים הפפטידיים שהיא משתתפת בהם , הדבר חיוני עבור מבנים כגון סיבובי בטא
**תפקיד האנזים הוא לזרז מעבר בין שני הסטריאו איזומרים הגאומטריים של פרולין -ציס וטרנס**
תהליך האיזומיריזציה הוא שלב איטי בקיפול חלבונים המכילים מספר שיירי ציסטאין , ועל כן קובע מהירות.
157
קונפיגורציית ציס עבור פרולין:
**שקף 80:** מתאר ש 99.95% מחומצות האמינו בקשר הפפטידי יהיו בקונפיגורציית טרנס , ורק 0.05% יהיו בציס. **פרולין יוצאת דופן** בכך ש 6% ממנה יהיו בקונפיגורציית ציס.
התופעה היא הודות לחנקן ה imino שנוצר כאשר קבוצת ה R שלה נסגרת.
שקף 81: השקף מתאר שחומצת האמין פרולין נפוצה מאד בסיבובי הטא , הודות ליכולתה הענפה לעשות קשר פפטידי מסוג ציס , היא חיוני ליצירת הזווית הנחוצה עבור מבנה ה β turn
158
קיפול חלבונים שגוי הוא הבסיס המולקולרי להמון מחלות גנטיות:
עמילואיד פיבריל:
עמילואיד פיבריל:
מדובר בפולי פפטידים שהמבנה הנאטיבי שלהם מכיל מבנים שניוניים מסוג בטא שיט. **במקרים מסויימים החלבון לא מספיק להתקפל כמו שצריך** , ואז אזורי הבטא האלה בחלבון אחד , מתחברים לאזורי בטא דומים בחלבון אחר ליצירת ליבת העמילואיד (שזה בעצם ערימה של משטחי בטא) , ואז כל מיני חלבונים שונים מתחברים לעמילואיד ליצירת הפיבריל , וכך מתקבל עמילואיד פיבריל.
**עמילואיד פיברילים הם חלבונים לא מסיסים** , וגורמים למגוון מחלות הנקראות בשמם הכולל **מחלות עמילודוזיות**
159
קיפול חלבונים שגוי הוא הבסיס המולקולרי להמון מחלות גנטיות:
Amyloid-β-peptide
Amyloid-β-peptide:
צורון זה מתחיל את חייו בכלל כשני אלפא הליקסים שהם חלק מהמבנה של חלבון יותר גדול , **לשני האלפא הליקסים האלה יש חומצות אמינו ארומטיות שפונות מהם החוצה.** מסיבה כלשהי , החלבון עובר חיתוך פרוטאוליטי למספר סגמנטים , ואזור ה Amyloid-β-peptide מתנתק ממנו **ומאבד את מבנהו האלפא הליקלי** לכדי משטחי בטא שנערמים זה מעל זה ויוצרים עמילואיד. **שיירי הצד הארומטיים מסייעים בייצוב מבנה העמילואיד**.
עמילואיד גורם למחלת האלצהיימר
**עמילואיד בטא מורכב משתי שכבות של משטחי בטא , המתארגנים בצורה פרללית**
160
מה זה עמילואיד פיבריל:
במקור אלה הם חלבונים מסיסים המיועדים להיות מופרשים מהתא.
עקב כשל בתהליך הקיפול , נוצר פפטיד לא מסיס (אגרגט) , המורכב מערימות של משטחי בטא (עמילואיד) , שאליהם נקשרים כל מיני חלבונים אחרים (עמילואיד פיבריל).
כאמור , במצבו התקין , החלבון היה אמור להיות חלבון מסיס שמופרש מהתא , אולם פגם בקיפול הפך אותו ללא מסיס , המבנה שלו הוא מאד הדוק וחסר התפצלויות.
161
מחלות עמילואידוזיות:
מגוון מחלות המתפתחות עקב הצטברות פיברילים עמילואידיים **בחלל הבין תאי**.
רוב מולקולות החלבון מתקפלות בצורה תקינה , ולכן המחלות מתפתחות לאט. אצל חלק מהאנשים , ע״ר מוטציה מוחדת , חומצה אמינית לא ארומטית מומרת בחומצה אמינית ארומטית בעמדה שיוצרת העדפה ליצירת סיבי עמילואיד , וכך יתכן שהמחלה תתפתח מהר יותר.
162
קיפול חלבונים שגוי הוא הבסיס המולקולרי להמון מחלות גנטיות:
ציסטיק פיברוזיס CF
הבסיס המולקולרי של ציסטיק פברוזיס הוא גם כן קיפול לא תקין של חלבונים , בעצם **חלבון ממברנלי בשם CFTR שהוא תעלה עבור יוני כלור**.
יש מספר מוטציות הגורמות למחלה , הכי נפוצה היא מחיקה של פניל אלאנין בעמדה 508 של החלבון , הגורמת לו להתקפל בצורה שגויה , רוב החלבון עקב כך מושמד , מה שמשאיר את החולים עם מחסור בטרנספורטר.
163
מחלת הפריון:
Prion
זוהי מחלה ספונגופורמית הנגרמת ע״י חלבון **מזהם** שנקרא פריון.
פריון הוא חלבון שנמצא ברקמת המוח אצל כל היונקים במצב תקין , נמצא שמחסור בגן לפריון בעכברים לא גרם לשום מחלה.
המחלה מתפתחת כאשר החלבון מתקפל בצורה לא תקינה והופך מ PRPC , בעל מבנה אלפא הליקלי תקין , ל PRPSC , בעל מבנה דמויי עמילואיד של משטחי בטא לא תקין.
חלבוני PRPSC לא תקינים **מדביקים** חלבוני PRPC תקינים וגורמים להם לקבל צורה לא תקינה
ישנו בסיס גנטי למחלה , החלפת חומצת אמינו יחידה ברצף החלבון מעלה את הסיכוי להתפתחות המחלה
גורם לפרה המשוגעת.
164
מחלות spongiform:
מחלות שבהם המוח מתחורר ומקבלת מורה דמויית ספוג.
אלה מחלות נוירו דגנרטיביות הנוצרות מהצטברות חלבונים שהתקפלו לא נכון.
165
חלבון וליגנד:
ליגנד הוא כל מולקולה שחלבון מסויים קושר. זה יכול להיות מתכת , סוכר , חלבון אחר , או כל דבר שהוא !!
הקישור בין החלבון לליגנד הוא **קישור הפיך פר הגדרה**
הליגנד נקשר לחלבון באתר מיוחד שנקרא ״אתר הקשירה״ binding site
עבור אנזים , הליגנד יקרא סובסטרט !!
166
כיצד החלבון יודע לקשור ליגנד ?
גם החלבון וגם הליגנד נמצאים בתוך התא בין אלפי מולקולות אחרות , אז כיצד הם יודעים לקשור דווקא אחד את השני ?
הודות לספיציפיות שבינהם , אתר הקשירה של החלבון מתאים לליגנד מבחינת גודל , צורה , מטען , תכונות (הידרופובי/הידרופילי) וכך נוצרת ספיציפיות בינהם.
לחלבון נתון יכולים להיות מספר אתרי קשירה עבור מספר ליגנדים.
167
התאמה מושרית ושינויי קונפורמציה:
**כמעט תמיד** , קישור בין חלבון לליגנד מערב שינוי בקונפורמציית החלבון.
השינוי בקונפורמציה יכול להיות עדין , ויכול להיות ממש דרמטי , במהלכו סגמנטים של החלבון יכולים לנוע עד אפילו **מספר ננומטרים**.
מטרת השינוי בקונפורמציה של החלבון הוא להפוך את אתר הקשירה למתאים יותר לליגנד , ובכך מאפשר קשירה הדוקה יותר , תופעה זו נקראת **התאמה מושרית**.
עיקרון זה יכול להוות כמנגנון בקרה על קישור בין חלבון לליגנד , ליגנד אחד שקשור לחלבון יגרום לקונפורמציה ספיציפית בחלבון שתוריד זיקה לליגנד שני , ורק בשחרור הליגנד הראשון , ושינוי קונפורמציה בהתאם , החלבון יוכל לקשור את הליגנד השני.
168
התאמה מושרית בחלבונים בעלי מספר תת יחידות:
לעיתים קרובות בחלבונים כאלה , קישור ליגנד לתת יחידה אחת , יביא לשינוי בקונפורמציה שלה , השינוי בקונפורמציה של היחידה הזאת , ישפיע על הקונפורמציה של תתי היחידות האחרות.
169
המוגלובין וקבוצת heme:
אז heme היא הקבוצה הפרוסטטית של המוגלובין , בכל תת יחידה מבין ה4 של המוגחובין יש קבוצת heme אחת , ממה היא בנויה ?
קבוצת heme היא למעשה אטום ברזל הקושר טבעת של פרוטופורפרין
פרוטופורפרין הוא מקרה מיוחד של טבעת הנקראת פורפרין
פורפרין בנוי מארבע טבעות pyrrole הקשורות בינהם בקשרים כפולים הנקראים methene
טבעת pyrrole בנויה מגליצין וסוקציניל קוA
170
מדוע צריך להעביר חמצן בגוף דרך חלבונים מיוחדים ?
1) חמצן אינו מסיס במים (סרום הדם) ולכן תנועתו בדיפוזיה למרחקים אינה יעילה ואינה מספקת את צורכי הרקמות
2) הצורך בחלבוני תובלה מיוחדים לחמצן נובע מהעובדה ששייר הצד של אף אחת מחומצות האמינו בגוף **אינו מתאים לקשירת חמצן באופן הפיך** , ועל כן אינו מתאים לפריקה שלו , ומכאן הצורך במתכות מעבר כגון חמצן ונחושת.
3) לא ניתן להעביר חמצן דרך ברזל חופשי כי הברזל החופשי עלול להגיב עם חמצן וליצור רדיקלים חופשיים
4) לא ניתן להעביר חמצן דרך קבוצת heme חופשית (שלא כחלק מחלבון) , כי הדבר משאיר לברזל קשר קאורדינטיבי חופשי (שבמקור קושר את ההסטדין הפרוקסימלי) , הקדר הזה עלול לקשור אטום חמצן נוסף , מה שגורם לחמצונו , והפיכתו לאטום ferric מחומצן שלא יכול להעביר חמצן.
171
מבנה ההמוגלובין:
מדובר בחלבון בעל מבנה רביעוני שמורכב מ 4 תת יחידות:
- שתי תת יחידות α זהות
- שתי תת יחידות β זהות
כל תתי היחידות קשורות זו לזו בקשרים אלקטרוסטטיים , וזה בעצם מה שמחזיק את המבנה הרביעוני של המוגלובין.
172
איזה אטום נמצא בקבוצת heme בהמוגלובין / מיוגלובין ?
אטום ברזל מחוזר בעל מטען 2+, בעצם ferrous
הקישור הקאורדינטיבי של הברזל לחנקנים בפרוטופורפרין מונע ממנו להפוך ל ferric , שזה בעצם המצב המחומצן והבלתי פעיל של ברזל , שהוא בעל מטען 3+
173
כיצד משפיע קישור החמצן לברזל בהמוגלובין ?
התכונות האלקטרוניות של ה heme ושל הברזל משתנות , ולכן בדם ורידי ענינבחמצן הצבע הוא סגלגל כהה , ובדם עורקי עשיר בחמצן הצבע הוא אדמדם בהיר
174
השפעת CO ו- NO על קישור חמצן ל heme:
שני הגזים הם בעלי אפיניות יותר גבוהה לברזל מאשר חמצן , וזה אומר שני דברים:
- נוכחות שלהם עלולה למנוע קישור של חמצן ל heme
- עלולים לנתק חמצן שכבר קשור
אחד מתפקידי ההמוגלובין / מיוגלובין הוא לעשות sequestering לקבוצת ה heme , ובכך למנוע גישה של אותם מולקולות אליה
175
תיאור כמותי של ריאקציית חלבון ליגנד:
הקישור בין החלבון לליגנד הינו קישור הפיך , הניתן לתיאור ע״י משוואת שיווי משקל:
כאשר חלבון - P , ליגנד - L מתחברים , נקבל:
P + L = PL
Ka = [PL]/[P]*[L]
כאשר Ka הוא קבוע האסוציאציה
176
תכונותיו של קבוע האסוציאציה Ka במשוואה
P+L=PL
- מתאר את שיווי המשקל בין הקומפלקס למרכיביו
- - **הוא אינו קבוע קצב**
- מהווה מדד לאפיניות שבין P ל L
- בעל יחידות
- הוא יחס בין שני קבועי קצב ?
ככל שערכו של Ka גבוה יותר , זה אומר שהאפיניות בין החלבון לליגנד גדולה יותר , מתמטית זה מסתדר כי זה אומר שה PL במונה גדל , כלומר בשיווי משקל יש יותר קומפלקסים PL מאשר המרכיבים הבודדים.
177
הגדר מה היא זיקה (אפיניות) בין חלבון לליגנד:
זיקה מבטאת את המרחק שצריך להיות בין שני צורונים כדי שהם יקשרו ותהיה בינהם אינטראקציה. זיקה גבוהה אומרת שהמרחק יכול להיות כדול ועדיין תתרחש אינטראקציה , זיקה נמוכה אומר שכדי שצהיה אינטראקציה המרחק חייב להיות קטן.
זיקה מתייחסת גם לריכוזים באופן עקיף. כי מרחק הוא מדד לריכוז , ככל שריכוז הצורונים בתמיסה קטן יותר , כך המרחק בינהם גדול יותר , ולכן זיקה אומר שהצורונים יכולים להתחבר גם בריכוזים קטנים.
זיקה רלוונטית כאשר הקישור בין הצורונים הוא הפיך ולא קוולנטי.
178
מה משפיע על זיקה ?
מבנה , אם יש התאמה מבנית בין החלבון לליגנד , תהיה בינהם זיקה גבוהה.
179
הגדר מהו קבוע קצב:
קבוע קצב מתאר את החלק היחסי של מולקולות , ממאגר מסויים , שמגיבות בפרק זמן נתון.
קבועי קצב הם בעלי יחידות (שקף 159)
180
שקף 163
עבור ליגנד A , לאיזה מבין החלבונים יש אפיניות גבוהה יותר, X או Y ?
- בציר X מובא ריכוז הסובסטרט
- בציר y מובא ערך θ שבריכוזי ליגנד נמוך פרופורציונלי לאחד חלקי Kd
שתי דרכים להסתכל על זה:
1) בריכוז סובסטרט נתון , אנחנו רואים שערך θ עבור חלבון X יותר גבוה מערך θ עבור חלבון y. לפי הפרופורציונליות שקבענו בין θ ל Kd , ככל ש θ גבוהה יותר , משמע Kd נמוך יותר , וככל ש Kd נמוך יותר האפיניות גבוהה יותר.
2) נסתכל על θ=0.5 , בערך זה של θ יוצא ש [L]=Kd (משוואה שקף 160) , כאשר מתקיים Kd = [L] , זהו ריכוז הסובסטר שבו 50% מאתרי הקישור של החלבון תפוסים. ניתן לראות שהדבר מתקיים בריכוז נמוך יותר של חלבון X מאשר חלבון y , משמע נדרש מעט סובסטרט כדי לתפוס 50% מהחלבון X , והרבה סובסטרט כדי לתפוס 50% מחלבון y , משמע האפיניות של חלבון x עבור הסובסטרט גבוהה יותר.
181
האם אפיניות בין חלבון לליגנד היא בעלת ערך קבוע ?
לא !
אפיניות יכולה להשתנות , גם אם השחקנים הם אותם שחקנים.
אחד הדברים המשפיעים על אפיניות הוא מבנה של החלבון (או הליגנד) , כך למשל האפיניות בין CO לקבוצת heme **חופשית** (שתמלא תפקיד החלבון) היא פי 20000 יותר גדולה מהאפיניות שבין חמצן ל heme. אולם ברגע שקבוצת ה heme היא חלק ממיוגלובין , האפיניות של CO תהיה גבוהה מזו של חמצן רק פי 20
182
קישור של CO לקבוצת heme לעומת קישור O2:
- חמצן נקשר לקבוצת ה heme בזווית
- פחמן חד חמצני CO נקשר ל heme **חופשיה** בקו ישר , ול heme **במיוגלובין** בזווית קטנה (קטנה יותר מהזווית של החמצן). הזווית נוצרת עקב הפרעה סטרית של היסטדין E7 (הדיסטלית)
אני שם לב שקישור בקו ישר משמעו יותר זיקה או קשר יותר חזק (נתקלנו בזה גם בקשרי מימן).
183
היסטדין דיסטלי לעומת היסטדין פרוקסימלי:
ההיסטדין הפרוקסימלי הוא ההסטדין שקשור לברזל דרך אחד הקדרים הקאורדינטיביים המאונכים שלו. ההסטדין הזה יקשור את הברזל **בנוכחות ליגנד ובהעדר ליגנד** , לא משנה (O2 או CO). היסטדין זו נקראת F8
היסטדין דיסטלית , שנקראת E7 , אינה יכולה לקשור את הברזל כי היא כשמה רחוקה מדי. ברגע שנקשר חמצן , היא תצליח ליצר עם אחד מאטומיו קשרי מימן.
איור 5-5 שקף 168
אסוציאציה: היסטדין Fרוקסימלי = F8
184
כיצד CO קושר את אטום הברזל בקבוצת ה heme ?
דרך הפחמן ,
שקף 167
185
מנה את חומצות האמינו הקושרות heme בהמוגלובין או מיוגלובין:
1) היסטדין פרוקסימלי F8
2) היסטדין דיסטלי E7 (קשרי מימן עם החמצן) - קשר זה מתאפשר רק הודות לקשר הקטרדינטיבי בין החמצן לברזל שיוצר דיפול קטן על החמצן.
3) חומצות האמינו ואלין ופניל אחאנין שעושות אינטראקציות הידרופוביות עם ה heme
186
4 עובדות מעניינות שלא ידעתם על תאי דם אדומים:
1) כמעט כל החמצן שיש לנו בדם נמצא קשור להמוגלובין בתוך תאי דם אדומים.
2) תאים אדומים בשלים מתפתחים מתאי גזע הנקראים **המוציטובלסטים.** hemocytoblasts. בתהליך ההבשלה התאים האדומים מייצרים כמויות גדולות של המוגלובין , ואז מאבדים את הגרעין , ER , מיטוכונדריה ואת יכולתם להתחלק ולייצר חלבונים נוספים (נושמים אק בגליקוליזה?)
3) תא דם אדום בוגר הוא סוג של שקיק ריק שמכיל המוגלובין (המוגלובין מהווה 34% ממשקל התא)
4) תפקידו של תא אדום בוגר הוא לשנע חמצן בין הרקמות , חוץ מזה הוא לא באמת מסוגל לעשות כמעט כלום. אורך חייו כ 120 ימים בבני אדם.
187
המוגלובין לעומת מיוגלובין:
בעוד שהמוגלובין הוא טטראמר שמורכב מ 4 תת יחידות (או דימר פרוטומרי) , מיוגלובין הינו מונומר , שבנוי משרשרת פוליפפטידית אחת (154 ח״א).
המוגלובין בוגר מכיל שתי תת יחידות זהות מסוג אלפא (141 ח״א כל אחת) , ושתי תת יחידות זהות מסוג בטא (146 ח״א כל אחת).
שתי תת היחידות , אלפא ובטא , שונות ביותר מ 50% ברצף חומצות האמינו שלהם , אך הן בעלות מבנה מרחבי דומה.
רצף חומצות האמינו המרכיב את השרשרת הפפטידית של יחידה אלפא , יחידה בטא , ומיוגלובין משותף רק ב 27 חומצות אמינו , אך לשלתם יש מבנה מרחבי דומה. **מיוגלובין ויחידה בטא דומים יותר זה לזה** מאשר יחידה אלפא לשניהם.
188
שתי קונפורמציות של המוגלובין:
המוגלובין יכול להימצא בשתי קונפורמציות:
- T , tense = low affinity
- R , relaxed = high affinity
**חמצן יכול לקשור המוגלובין בשתי הקונפורמציות שלו** , אך לרוב נמצא אותו קושר המוגלובין R יותר מאשר המוגלובין T , הודות לאפיניות הגבוהה של מצב R
ניתן להתייחס למצב T כאל קונפורמציה **לא קושרת חמצן** , ואל מצב R **כקונפורמציה קושרת חמצן.**
קישור מולקולת חמצן להמוגלובין T משרה ביחידה הקושרת עצמה שינוי מבני והופך אותה ליחידה R. השינוי המבני של התת יחידה משרה בתורו שינוי מבני ביחידות הסמוכות , מה שמעלה בצורה **קאופרטיבית** את האפיניות בין החמצן וההמוגלובין
189
כיצד קישור חמצן משפיע על מבנה ההמוגלובין ?
הימוגלובין יכול להמצא בשני מצבים , T ו- R.
בקונפורמציה T יש **המון אינטראקציות יוניות בפני השטח של הדימר אלפא-בטא** , מה שהופך אותו לפחות אפיני כלפי חמצן.
כעת חמצן נקשר , הדבר עושה שני דברים:
- משנה את היחידה הקושרת מ T ל R (כלומר גורם לשינוי מבני ברמת התת יחידה)
- שני הדימרים אלפא-בטא מחליקים אחד לעבר השני , מה שגורם לצמצום הכיס בין יחידות בטא (כלומר גורם לשינוי מבני ברמת הטטראמר)
190
מאפייני המוגלובין T:
קיימים המון אינטראקציות יוניות בפני השטח של הדימר אלפא-בטא , מה שהופך את הקונפורמציה הזו לפחות אפינית כלפי חמצן.
191
מדוע מיוגלובין לא יכול להיות מוביל החמצן בדם ?
מיוגלובין הוא מונומר , הוא קושר חמצן בצורה **היפרבולית** , כל חלבון באשר הוא שקושר חמצן בצורה היפרבולית אינו מתאים לשינועו בין הרקמות. עקומה היפרבולית (ראה גוגל) אומרת **שהמיוגלובין אינו יכול לעבור בין מצבי אפיניות שונים** כלפי חמצן (תכונה קריטית לשינוע חמצן בין הריאות לרקמות) , ״חלבון שקושר אליו חמצן באפיניות גבוהה בלבד , יקשור חמצן בריאות אך לא יצליח לשחרר הרבה ממנו ברקמות״. ולכן מיוגלובין לא מתאים לתובלה של חמצן בדם. הדבר נכון גם עבור חלבונים שקושרים חמצן באפיניות נמוכה , הם פשוט לא יצליחו לקשור אותו בריאות , חרף ריכוזו הגבוה.
קישור היפרבולי: החלבון קושר את הליגנד שלו באפיניות נתונה , ככל שיש יותר ליגנד , כך יותר חלבון יהיה קשור , עד שמגיעים למצב של רוויה.
192
מדוע המוגלובין מתאים להעביר חמצן בדם בין הרקמות ?
המוגלובין הוא טטרמר , הקישור שלו לחמצן הינו קישור **קאופרטיבי** , משמע , ההמוגלובין יכול לנוע בין מצבי אפיניות גבוהה כלפי חמצן לאפיניות נמוכה. תכונה זו מאפשרת להמוגלובין לקשור חמצן בריאות כשריכוזו גבוה (לחץ חלקי 13.3) , כך המון HbT יהפוך להיות HbR … אך זה מאפשר לו לשחרר את החמצן ברקמות (לחץ חלקי של חמצן 4)
193
עקומה סיגמואידלית:
ערומה בעלת צורת S
עקומה סיגמואידלית מבטאת קישור קאופרטיבי , שבעצמו מבטא יכולת של החלבון לעבור בין מצבי אפיניות שונים , גבוהה ונמוכה.
תכונת הקאופרטיביות של ההמוגלובין הופכת אותו לרגיש כלפי ריכוזי חמצן שונים , אפיניות גבוהה בריכוזים גבוהים , ואפיניות נמוכה בריכוזים נמוכים.
194
שקף 174 גרף:
רואים את ההבדל בין קישור קאופרטיבי (עקומה סיגמואידלית אמצעית) , לבין קישור היפרבולי , פעם כשהחלבון הוא בעל אפיניות גבוהה לחמצן , ופעם כשהחלבוןנהוא בעל אפיניות נמוכה.
באפיניות גבוהה: החלבון קושר את הליגנד גם בריכוזי ליגנד נמוכים וחא משחרר אותו (עבור חמצן , ברקמות) .
אפיניות נמוכה: החלבון לא מצליח לקשור את הליגנד גם בריכוזי ליגנד גבוהים (עבור חמצן , בריאות)
קאופרטיבי: החלבון קושר את הליגנד בריכוזי ליגנד גבוהים , ומשחרר אותו בריכוזי ליגנד נמוכים (עבור חמצן , נקשר בריאות משוחרר ברקמות).
195
עקומת קישור היפרבולית אומרת שקישור הליגנד אינו משרה שינוי קונפורמציה בחלבון ?
לא נכון ,
אין הכרח , ייתכן שקישור הליגנד כן משרה שינוי קונפורמטיבי , ויתכן שלא.
הדבר רק אומר שבחלבון יש **יחידה אחת הקושרת את הליגנד** , יתכן שמדובר במונומר , או דימר או אוליגומר , אך זוהי תת יחידה אחת שקושרת את הליגנד , ולכן לא תתכן קאופרטיביות.
196
אפקט בוהר:
מתאר את השפעת ערך ה pH של התמיסה וריכוז ה CO2 בה על האפיניות של ההמוגלובין לחמצן.
ב pH נמוך + ריכוז CO2 גבוה (רקמות): האפיניות לחמצן יורדת.
ב pH גבוה + ריכוז Co2 נמוך (נימי ריאות): האפיניות לחמצן עולה.
197
מדוע ברקמות ובנימים פרפריים ה pH נמוך וה CO2 גבוה ?
פחמן דו חמצני הוא התוצר הסופי של תהליכי המטבוליזם ברקמות , התוצר השני הוא מים.
שני התוצרים מגיבים יחדיו בריאקציית מיום של פחמן דו חמצני , ליצירת פרוטון ויון ביקרבונט:
CO2 + H2O = H + HCO3
ולכן אנחנו רואים ברקמות שיש CO2 גבוה בגלל המטבוליזם , וכן H גבוה (pH נמוך) בגלל תהליך המיום של ה CO2.
עמוד89: pH גבוהה בפריפריה בגלל ביקרבונט גבוה ?
198
אפקט בוהר והשפעתו על שינוע חמצן בגוף:
בתאים ברקמות הפרפריות נוצר בסוף תהליך המטבוליזם פחמן דו חמצני ומים:
**Glucose -> CO2 + H2O**
הפחמן הדו חמצני עובר בדיפוזיה מהרקמה לאריתרוציט בנים שלידה , בתוך האריתרוציט מתרחשת התגובה הבאה ע״י האנזים קרבוניק אנהידראז carbonic anhydrase:
**CO2 + H2O = H + HCO3**
כך אנחנו רואים שבתוך האריתרוציט בפרפריה יש בהתחלה ריכוז CO2 גבוה , שאז מביא לריכוז H גבוה (pH נמוך). שני אלה לפי אפקט בוהר מורידים את האפיניות של ההמוגלובים לחמצן , כך שיותר המוגלובין משחרר חמצן , שעובר בדיפוזיה מהאריתרוציט לרקמה , ובזה חמצנו את הרקמות.
ההמוגלובים באריתרוציט כרגע קושר CO2 ו- H ומוביל אותם לכליות ולריאות (מה קורה בכליות?)
בריאות , ריכוז חמצן גבוה וריכוז CO2 נמוך , חמצן נכנס מהנדיות לאריתרוציט , ה CO2 משתחרר מההמוגלובין , עובר לנאדיות בדיפוזיה ונפלט החוצה.
199
תהליך ההידרציה (מיום) של פחמן דו חמצני:
מתרחש ע״י האנזים קרבוניק אנהידראז carbonic anhydrase
האנזים קיים בכמויות גדולות באריתרוציטים , אך לא רק (אני מאמין שהוא קיים גם ברקמות פרפריות)
CO2 + H2O = H + HCO3
200
מלבד חמצן , מה מוביל המוגלובין בגוף ?
פחמן דו חמצני ופרוטונים.
כ 20% מה CO2 הנוצר ברקמות מועבר ע״י המוגלובין לריאות , השאר משתתף במערכת הבופר של הדם (הופך להיות ביקרבונט וCO2 מומס).
כ 40% מהפרוטונים הנוצרים ברקמות (מיום CO2) מועברים ע״י המוגלובין לכליות , השאר נספגים במאכר הביקרבונט של הפלסמה (הופכים לחומצה קרבונית?)
201
אפקט בוהר:
הקשר בין פרוטון , המוגלובין וחמצן:
המדוואה שמתארת את הקשר הזה היא:
HHb + O2 = HbO2 + H
רואים בש.מ שעליה בריכוז הפרוטונים , תטה את הריאקציה שמאלה , כך שיותר ויותר חמצן יהיה חופשי ולא קשור להמוגלובין , וזה ביטוי לחוק בוהר ש pH נמוך (ריכוז פרוטונים גבוה) מוריד אפיניות לחמצן , ולהפך , ריכוז חמצן גבוהה , מוריד אפיניות לפרוטונים.
שקף 178 , לשים לב לגרף.
202
2,3 BPG:
2,3 ביספוספוגליצרט
1) משפיע על הזיקה בין חמצן להמוגלובין , **אך הוא אינו חלק מאפקט בוהר**
2) 2,3 ביספוספוגליצרט הוא תוצר לואי של גליקוליזה , שהיא תהליך אוניברסלי , ולכן הוא נמצא בכל התאים בגוף , **במיוחד באריתרוציטים בהם נמצא בריכוז גבוה יחסית**
3) **2,3 ביספוספוגליצרט מוריד זיקה לחמצן** בהתאם לריכוז של חמצן. בריכוז גבוה מוריד מעט , בריכוז נמוך מוריד עוד יותר.
4) על טטרמר של המוגלובין , **יכולה להיקשר מולקולת 2,3 ביספוספוגליצרטים אחת לכל היותר**. היא נקשרת בכיס שבין תת יחידות בטא , ומייצבת קונפורמציית T
5) מכיל שני פוספטים רחוקים (ביספוספו) ולכן על המולקולה מטען דו ערכי שלילי
6) 2,3 ביספוספוגליצרט נקשר לאתר המרוחק מאתר קישור החמצן (כאמור בין שתי יחידות בטא)
203
כיצד 2,3 ביספוספוגליצרט משפיע על הקישור בין חמצן להמוגלובין ?
הוא נקשר על ההמוגלובין , בין שתי יחידות בטא , הריק מאתר קעשור החמצן , **ומבקר את אפיניות קשירת החמצן להמוגלובין בהתאם ללחץ החלקי של החמצן**. כלומר בריאות הוא מוריד את האפיניות מעט , וברקמות מורידה הרבה.
כעיקרון , מה ש 2,3 ביספוספוגליצרט עושה זה **לעודד עוד יותר את תפקיד ההמוגלובין כנשא חמצן** ומספק דוגמה **לאפנון אלוסטרי הטרוטרופי**.
ולכן , 2,3 ביספוספוגליצרט חיוני לתפקוד בני אדם בריכוזי חמצן נמוכים (פסגה של הר למשל) , בגלל שהוא מעודד תפקוד של המוגלובין - מוריד את האפיניות של החמצן (במיוחד בפרפריה) , אז גם בריכוזי חמצן נמוכים ההמוגלובין עדיין יוכל לפרוק חמצן ברקמות , ובכך נמנעת היפוקסיה.
204
כמה חמצן מוביל הדם בגובה פני הים לעומת פסגת הר גבוה ?
במצב תקין , המוגלובין מעביר כ 40% מכמות החמצן המקסימלית שבתאוריה ניתן להעביר בדם.
דבר כזה מתרחש בגובה פני הים אצל אדם בריא , אך גם בפסגות ההרים הודות ל 2,3 ביספוספוגליצרט
205
היכן נקשר 3,3 ביספוספוגליצרט על ההמוגלובין ?
הוא נקשר בחלל שבין שתי תת יחידות בטא , בעצם החלל הזה קיימם כאשר ההמוגלובין נמצא בקונפורמציית T , אי לכך , קידור 2,3 ביספוספוגליצרט מייצב את מצב T ומעכב מעבר לתצורת R , בזה הוא מוריד אפיניות לחמצן.
בין תת יחידות בטא , יש אזור שמכיל חומצות אמינונחיוביות , וזה מושך את ה 2,3 BPG שיש עליו מטען 2-
כזכור , מעבר ממצב T ל R מצמצם את החלל הזה שבין יחידות בטא.
206
כיצד משפיע 2,3 BPG על המוגלובין עוברי ?
משפיע פחות מאשר השפעתו על המוגלובין בוגר.
בעובר במקום יחידות בטא ישנם שתי יחידות גאמא (שני אלפא ושני גאמא) , 2,3 ביספוספוגליצרט קושר יחידת גאמא באפיניות נמוכה מאד , מה שאומר **שההמוגלוהין העוברי יותר אפיני לחמצן מאשר המוגלובין בוגר (של האם)** , וכך העובר ״גונב״ את החמצן מהדם של האימא.
207
ממה נגרמת אנמיה חרמשית?
מוטציה שגורמת להחלפה של **חומצה אמינית בודדת** , בתת יחידות בטא.
כתוצאה מההחלפה הזאת , נוצר אזור הידרופובי **על פני** יחידות בטא של ההמוגלובין המוטנטי כאשר הוא במצב **דיאוקסי** (כלומר לא קושר חמצן). אזורים אלה נדחים מהמדיום המימי , וגורמים לאגרגציה של המוגלובינים מוטנטיים , כך נוצרים אגרגטים לא מסיסים של המוגלובין.
המוגלובין פגום נקרא המוגלובין S
המוגלובין תקין נקרא המוגלובין A
אסוציאציה: S**ickle cell = Hb S**
208
אנמיה חרמשית:
היא מחלה גנטית אוטוסומלית רציסיבית (דורשת ששני האללים יהיו פגומים)
קיימים כ 500 וריאציות של המחלה , כסוג הגן שנפגע , כן הואיאציה. ברובם הפגם נגרם מהחלפה של חומצה אמינית אחת.
המחלה מתאפיינת בכך שבדם של אנשים חולים יש יחסית הרבה אריתרוציטים לא בשלים , ואלה הבשלים יש להם צורת חרמש , שנגרמת מאגרגציההשל המוגלובין S
המוטציה מתבטאת בחומצה אמינית גלוטמאט שמוחלפת בואלין בעמדה 6 בתת יחידות בטא , הגלוטמט ההדרופובי גורם ליצירת משקעים של **דה אוקסי**-המוגלובין S לא מסיסים
המוגלובין S מכיל שני מטענים שליליים פחות מהמוגלובין A (איד מכל יחידת בטא על כל גלוטמט שירד)
209
חקר חלבונים:
1) קודם כל יש צורך להפיק חלבונים , בד״כ הם מופקים מחיידקים , הצמצית התאית שאני מפיק נקראת crude extract.
ה crude extract מופק בשיטה של הומוגנציה , בעצם שוברים את ממברנת התא , ואז כל תכולתו נשפכת החוצה , בהומוגנציה הממברנה של האברונים נותרת שלמה.
2) צריך להפריד את החלבונים , אני מעוניין לחקור חלבון מסויים , ולכן אשאף שרק הוא יהיה בתמיסה
הפרדת החלבונים לפי תכונות , גודל , מטען וכו׳ , נקראת פרקציונציה.
210
שיטות הכנה:
צנטריפוגה:
שיטה שמשמשת להפרדת צורונים דרך סרכוז
**עיקרון ההפרדה: משקל**
בעצם אחרי שהפקתי crude extract , אני מפריד מרכיבים תאיים שונים לפי המשקל שלהם.
במהירות סיבוב נמוכה , ישקעו צורונים כבדים , ככל שמהירות הסיבוב תעלה , צורונים יותר ויותר קטנים ישקעו
211
כיצד ניתן להפריד מרכיבים תאיים בעזרת צנטריפוגה ?
ע״י העלאת המהירות באופן הדרגתי.
מתחילים מסל״ד נמוך , משקיעים אברונים כבדים , כגון גרעין. כעת נוציא את הגרעינים מתחתית המבחנה
בשלב השני אעלה מעט את מהירות הסרכוז ואשקיע אברונים מעט יותר קלים , כגון מיטוכונדר. אמצא את המיטוכונדריה מתחתית במבחנה
בשלב השלישי אעלה את המהירות עוד יותר , ואשקיע ריבוזומים … וכן הלאה.
**חומרים מסיסים (כגון חלבונים) אינם שוקעים** ולכן , שיטה זו אינה טובה להפרדת חלבונים (את רובם). אלה היא יכולה להיות טובה עבור הוצאת אברונים.
שקף 192
212
בתום כל סבב בצנטריפוגה נוצרות שתי פאזות: pallet ו- supernatant , תאר מה אלו:
פאלט: החומר ששקע
סופרנטנט: התרחיף שנשאר למעלה
213
צנטריפוגה עם גרדיינט:
במבחנה שאני מסרכז אני יוצר גרדיינט של סוכרוז , כך שככל שנעים למטה במבחנה ריכוז הסוכרוז עולה (ריכוז הכי נמוך למעלה והכי גבוה למטה).
אני שם את ה crude extract בראש המבחנה ומסרכז , כל צורון תאי ינוע כעת ויעצור באזור של המבחנה שבו ריכוז הסוכרוז תואם את הצפיפות שלו.
בשיטה זו ניתן להפריד מספר מרכיבים בו״ז
שקף 190
214
בעת פרקציונציה דרך צינטריפוגה , ה crude extract התאי מוכנס למבחנה , התמיסה במבחנה חייבת להיות:
איזו אוסמוטית לאורגנלות.
215
שיטות הכנה:
דיאליזה:
אחרי שהוצאנו את האברונים מה crude extract , נרצה להתקדם. ניתן בשלב הזה להשתמש בשיטת דיאליזה להמשך ניקוי התמצית.
בשיטה זו **ניתן להפריד חלבונים** ומומסים קטנים , בניגוד לצנטריפוגה.
**עקרון הפרדה: גודל**
216
כיצד עובדת שיטת שקית דיאליזה ?
אני מכניס שקית עם חורים **בגודל מסויים וידוע** אל תוך תמיסה **היפוטונית** עם **בופר** מסויים בעל **חוזק יוני גבוה**. בתוך השקית נמצאים החלבונים שאני רוצה להפריד עם עוד כל מיני מלחים ויונים. הפרשי הריכוזים בין התמיסה לשקית מייצרים כח שמניע בדיפוזיה את היונים והמלחים מהשקית אל התמיסה , ומה שנשאר בפנים בעצם זה החלבונים.
**עיקרון ההפרדה בשיטה זו הוא לפי הגודל**.
חסרונות:
- כדי לתכנן את החורים בשקית בגודל הנכון אני נדרש לדעת מראש את גודל החלבון שאני רוצה לבודד כדי לשמור אותו בתוך השקית , וכך יש מקום לטעויות רבות
- אורכת זמן רב
התמיסה בסוף תגיע לשיוויון ריכוזים , ופה בעצם התנועה הדיפוזית של היונים תיעצר.
חוזק יוני הוא מדד ללחץ אוסמוטי.
217
שיטות הכנה:
Salting in / out:
**עיקרון הפרדה: מסיסות במים**
המסיסות של חלבונים **יורדת** בנוכחות מלחים מסויימים , תופעה זו נקראת **salting out**.
לפי עיקרון זה , אם אני מכניס אל תוך תמיסה (מימית) את המלחים הנכונים , במינון הנכון , אני יכול להפוך חלק מהחלבונים בתמיסה ממסיסים ללא מסיסים , אלו שהפכו לחא מסיסים ישקעו , ואלה שנותרו מסיסים נשארים צפים בתרחיף.
גרך זה יצרתי שתי פאזות , והפרדתימבין חלבונים על סמך מסיסות במים.
218
תאר את העררון הביוכימי של שיטת salting out:
בעצם , כשאני מכניס מלחים בריכוז מסויים לתמיסה המכילה חלבונים , המלח מתפרק , והיונים שנוצרים עוטפים את האזורים ההידרופיליים של החלבון ובעצם ככה הם שוללים ממנו את היכולת ליצר אינטראקציות עם המים , כי כל קשרי המימן והדיפול שלו עסוקים , וכך בכאילו החלבון הופך להיות הידרופובי ושוקע
עד כדי כך שחלבונים שבמקור מסיסים , יכולים לייצר אגרגטים לא מסיסים בשיטה זו ולשקוע.
219
Salting out לעומת salting in
ב salting out אנחנו משתמשים בריכוז מלחים גבוהה , ומורידים את המסיסות של החלבון
ב salting in , אנחנו שמים ריכוז נמוך של המלח , ומעלים את המסיסות
220
מלח שמשמש אותנו ב salting out ?
אמוניום סולפט
221
שיטות הכנה
כרומטוגרפיה בקולונה-
זוהי שיטת ההפרדה האחרונה , בעצם התחלנו מ crude extract , שלאחר מכן הוצאנו אברונים בצנטריפוגה , מלחים דרך דיאליזה , עשינו הפרדה על סמך מסיסות בשיטות salting. כעת נותרו החלבונים עצמם , שאותם אני רוצה להפריד , כדי לבודד את החלבון שאני רוצה לבחון.
לשם כך נשתמש בשיטה זו
222
כיצד פועלת הפרדה באמצעות כרומטוגרפיה דרך קולונה?
בשיטה זו אנחנו מזרימים תמיסה המכילה את החלבונים + בופר (נקראת ה mobile phase) , דרך מבחנה , בעצם קולונה , המכילה חומר מוצק ומלא בחורים , שיקרא המטריקס או ה stationary phase.
הפרדת החלבונים תהיה לפי תכונות המטריקס: גודל מטען , אפיניות ועוד.
מתחת לקולונה יש כוס , שמתמלאת במים , כי מים יוצאים לפני החלבונים שמעוכבים בצורה כזאת או אחרת במטריקס.
את התמיסה אני שואב דרך משאבה חד כיוונית שנקראת HPLC , תפקידה למנוע חזרה של התמיסה אחורה.
ככל שהקולונה **ארוכה יותר** , כך תתקבל הפרדה טובה יותר (רזולוציה טובה יותר). ככל שהניסוי אורך **זמן רב יותר** החלבונים יתחילו להתפזר ולנוע בדיפוזיה עד שנתקלים זה בזה , ולכן תתקבל הפרדה גרועה יותר
(רזולוציה נמוכה יותר)
223
מה משפיע על טיב ההפרדה (רזולוציה) בכרומטוגרפיה דרך קולונה ?
- אורך הקולונה , ככל שארוך יותר תהיה הפרדה טובה יותר
- משך זמן הניסוי , ככל שארוך יותר תהיה הפרדה גרועה יותר
224
אני שם לב שבשיטות להפרדת חלבונים , הרבה מהתמיסות מכילות לצד החלבונים גם בופר כלשהו.
!!
225
ישנם 3 סוגים של כרומטוגרפיה דרך קולונה:
כרומטוגרפיה על פי מטען החלבון , ion
exchange
כרומטוגרפיה על פי גודל החלבון , נקרא כם gel filtration
כרומטוגרפיה על פי אפיניות , מפרידה חלבונים לפי מה שהם קושרים.
226
כרומטוגרפיה מבוססת גודל:
Gel filtration
אנחנו מזרימים את הפאזה הניידת (שמכילה חלבונים ובופר) דרך חרוזים (הפאזה הסטציונרית). החרוזים הללו מכילים תעלות צרות וקטנות , אז מה קורה?
החלבונים הקטנים נכנסים לתוך התעלות שבחרוזים , וזה מעכב את התקדמותם במורד הקולונה , בעוד שהחלבונים הגדולים , גדולים מכדי להיכנס לחרוזים , אז הם פשוט זורמים בינהם עד שהם יוצאים ، בעצם עוקפים את המבוך.
227
האם אני נדרש מראש לדעת את גודל החלבונים ב כרומטוגרפיה מבוססת גודל כדי לתכנן את גודל החורים?
התשובה היא לא
אבל אני כן יכול לגלות גודל של חלבונים שאני לא מכיר בשיטה זו.
1) אני מתכנן חרוזים עם חורים שקבעתי את הגודל שלהם , חלבון שיוצא ראשון , הוא בודאות יותר גדול מהחור שבחרוז , גם אם אני לא יודע את גודלו המדוייק , אני יכול לשער.
2) אם אני מכיר את החלבון הראשון שיצא , ואני יודע שגודלו הוא 50KD , ואז יוצא חלבון שאני לא מכיר , ואז החלבון השלישי שיוצא אני מכיר אותו ויודע שגודלו הוא 40KD . אני מסיק שהחלבון השני הוא בין 40 ל 50 קילודלטון.
228
סדר יציאת החלבונים בפילטרציית ג׳ל
(כרומטוגרפיה לפי גודל)
החלבונים הגדולים יותר יוצאים ראשונים , כי כאמור מתקדמים בין החרוזים ולא נתקעים בהם. **בשלב הזה נראה שעם החלבונים הגדולים יצאה מעט תמיסה (בופר)**
כמשך הזמן , יצאו חלבונים קטנים יותר ויותר , וגם החלק היחסי של התמיסה שיוצא גדל , ולכן **חלבונים קטנים יוצאים אחרונים עם הרבה תמיסת בופר**.
**נפח אלוציה:** הנפח המצטבר של התמיסה שעברה דרך הקולונה ונאספה בפרקציות (המבחנות) עד שיצא החלבון אותו אנו בודקים.
229
מהו נפח אלוציה ?
מונח ששייך לעולם הכרומטוגרפיה מבוססת הגודל.
הנפח **המצטבר** שישנו בכוס שבתחתית הקונולונה בתום כל פרקציה.
קיים יחס הופכי בין נפח האלוציה לגודל החלבון. עם חלבונים גדולים , נפח האלוציה יהיה קטן , כי החלבון יוצא מהר וטרם הצטבר נוזל.
עם חלבונים קטנים , נפח האלוציה יהיה כדול , כי עד שאלו יוצאים הצטבר המון נוזל.
כגודל נפח הלוציה כך החלבון יצא מאוחר יותר , ועל כן קטן יותר.
230
חסרון של פילטרציית ג׳ל:
(כרומטוגרפיית גודל)
לא טוב בהפרדת חלבונים סיביים
231
כרומטוגרפיית שחלוף יונים:
Ion exchange
מתבססת על הבדלים בסוג וגודל המטען **הכולל** של החלבון ב **pH נתון**
הפאזה הסטציונרים מורכבת מפולימר resin , אליו קשורות **קבוצות טעונות** , המטען שעל הקבוצות יהיה מנוגד למטען שעל החלבון שאני רוצה לבודד
**משחלף קטיונים:** על ה resin תהיינה קבוצות טעונות שלילית , כך שחלבונים חיוביים יקשרו אליהם.
**משחלף אניונים**: על ה resin יש קבוצות טעונות חיובית , כך שחלבונים שליליים יקשרו אליהם.
232
תאר את סדר יציאת החלבונים במשחלף קטיונים:
היציאה דרך משחלף קטיונים תהיה לפי סוג המטען וגודלו (ב pH נתון).
במשחלף קטיונים המטען בקולונה יהיה שלילי , ולכן:
1) ראשונים לצאת הם חלבונים המכילים מטען שלילי גדול - דחיה רבה
2) חלבונים המכילים מטען שלילי קטן
3) חלבונים ניטרלים
4) חלבונים המכילים מטען חיובי קטן
5) חלבונים המכילים מטען חיובי גדול.
233
מדוע לא כל החלבונים החיוביים נשארים בתוך המשחלף ?
זה עניין של תחרות , כאשר מכניסים חלבונים בעלי מטען חיובי בגדלים שונים , אז החלבון שיש לו מטען יותר גדול יתחרה על קישור ה resin בהצלחה רבה יותר מחלבון בעל מטען חיובי קטן , כך שלחלבון עם המטען החיובי הקטן , בפועל , לא ישאר מה לקשור , והוא יוצא.
234
כיצד ניתן לשחרר חלבונים ״שנלכדו״ בקולונה במשחלף יונים ?
שתי דרכים:
1) ע״י שינוי ה pH בתוך הקולונה , כידוע המטען על החלבון הוא תלוי pH (פרוטונציה / דה פרוטונציה) , ולכן בשינוי ה pH , ישתנה גם המטען , והמשיכה האלקטרוסטטית בין שתי הפאזות תתבטל , כך שהחלבונים ישתחררו.
2) בעזרת יונים , אנחנו שוטפים את הקולונה עם תמיסת יונים בריכוזים הולכים ועולים , היונים יתחרו עם הקבוצות הטעונות שעל ה resin על הקישור של החלבונים וישטפו אותם. במשחלף קטיונים נשטוף עם תמיסת אניונים , במשחלף אניונים נשטוף עם קטיונים.
ניתן בהמשך לבודד את החלבונים דרך שקית דיאליזה.
235
כרומטוגרפיית זיקה:
עיקרון הפרדה: זיקה כימית
על החרוזים אני שם קבוצות כימיות - נקרא ליגנד - שקשורה אליהם באופן **קוולנטי.** כאשר לליגנד יש זיקה מסויימת לחומרים מסויימים , משמעות , לליגנד תכונות כימיות שיאפשרו לו לקשור חלבונים מסויימים בזיקה גבוהה.
אי לכך , חלבונים שאין בינם לבין הליגנד אפיניות , ישטפו קודם , וכך כגודל הזיקה החלבון ״״יתקע״ יותר זמן ויצא בשלב יותר מאוחר.
ליגנד יכול להיות נוגדן , חלבון אחר , סובסטראט מלאכותי , מולקולת דנא
236
חסרונות של כרומטוגרפיית זיקה:
1) יקרה מאד
2) אני נדרש לדעת למה החלבון שלי נמשך
דוגמאות:
חלבון: המוגלובין , ליגנד: heme
חלבון: ביוטין , ליגנד: אבידין
237
כיצד אני מבודד את החלבונים שנלכדו בפאזה הסטציונרית בכרומטוגרפיית זיקה ?
- ריכוז מלחים גבוה
- שינוי ב pH
- ריכוז גבוה של ליגנד , ״שחוטף״ את החלבונים מהחרוזים
בעיה שעלולה לצוץ זה שהחלבון נשטף עם הליגנד ולכן נדרשת בהמשך מניפולציה (שינוי תנאי הסביבה) לשחרור החלבון מהליגנד החופשי.
238
שיטות אנליטיות:
אחרי שבודדנו את החלבון , אנחנו רוצים ללמוד עליו וללמוד על תכונותיו ,
ולכן אנחנו נתחיל לעשות עליו אנליזה.
239
שיטות אנליטיות:
ג׳ל אלקטרופורזה-
זוהי שיטה אנליטית להפרדת חלבונים.
**עיקרון: נדידת חלבונים טעונים בשדה חשמלי**.
240
מה זה אלקטרופורזה ?
נדידת חלבונים טעונים בשדה חשמלי
241
תאר מבנה מכשיר אלקטרופורזה:
מדובר בג׳ל פולי אקריל אמיד שדרכו נעים החלבונים , בקצהו השמאלי יש בארית שאליה אני מכניס חלבונים **בעלי משקל מולקולרי ידוע** - זוהי קבוצת הביקורת.
מימינה ישנם מספר באריות שאליהן אני מכניס את החלבונים השונים שאני רוצה לקבוע את גודלם.
בקצה העליון של הג׳ל אני שם קטודה - בעצם יוצר קוטב שלילי , ובקצה התחתון אני שם אנודה - בעצם יוצר קוטב חיובי.
את החלבונים אני עוטף בדטרגנט שנקרא SDS
242
מה הם תכונות הג׳ל במכשיר אלקטרופורזה ?
הג׳ל שמשמש אותנו נקרא פולי אקריל אמיד או PAGE.
הג׳ל הינו סבוך ובנוי בצורת שתי וערב
הג׳ל יוצר **גרדיינט** , כך שככל שנעים למטה הצפיפות שלו עולה , ועל כן במהלך ההרצה לחלבונים יותר קטנים יהיה יותר קל לנוע עד לתחתית הג׳ל , בעוד שחלבונים גדולים נוטים להישאר בחלק העליון כי קשה להם לנוע בתסבוכת של הג׳ל
תכונה נוספת של הג׳ל זה שהוא מונע תופעה שנקראת **הסעה** , שזו תנועה דיפוזית של חומרים לפי טמפרטורה. בעצם בגלל המרקם הסמיך של הג׳ל תופעת ההסעה נמנעת (אופיינית למדיום נוזלי) וחלבונים לא נעים בג׳ל בדיפוזיה (שהיא תנועה אקראית של החומר) **אלא רק הודות לשגה החדמלי**.
243
הבארית השמאלית , קבוצת הביקורת:
לבארית זו אני מכניס חלבונים בעלי משקל מולקולרי ידוע , הם נעים במורד הג׳ל הודות לשדה החשמלי שיצרתי , ונעצרים באזורים התואמים לצפיפות שלהם. כך אני לומד לאורך הג׳ל איזה אזור מתאים לאיזה משקל מולקולרי של החלבונים. וכך , חלבון שאני לא מכיר , ברגע שנעצר באזור מסויים אני יכול לגלות את משקלו.
244
למה משמש הדטרגנט SDS ?
בעצם הוא מקנה לכל החלבונים בתמיסה מטען חשמלי שלילי , וזה משרת שני דברים:
1) מונע מחלבונים שהם חיוביים במקור לנוע לכיוון הקטודה , בעצם מבטיח תנועה חד כיוונית של החלבונים
2) מבטל בכלל כל השפעה של מטען החלבון הנאטיבי על תנועתו בפולי אקריל אמיד , **כך שהפרמטר היחיד כעת שמשפיע על נדידת החלבונים הוא משקל מולקולרי**.
245
תכונותיו של הדטרגנט SDS:
זהו דטרגנט חזק שהורס את מבנה החלבון , ולכן אלקטרופורזה אינה משמשת להפרדת חלבונים כי המבנה המרחבי של החלבון נהרס (היחיד שנשמר זה מבנה ראשוני).
כדטרגנט , הוא יודע לחבר בין מולקולות הידרופוביות למולקולות הידרופיליות , בעצם הוא יודע להיקשר לאזורים הידרופוביים בחלבון , ולמסך על המטען הנאטיבי שלו.
חלבון קושר SDS פי 1.4 ממשקלו , בחישוב זה יוצא מולקולת SDS אחת על כל **שייר** חומצת אמינו
מבנה: שרשרת של 12 פחמנים שבקצה שלה קבוצת סולפט (מטען שלילי) + אטום נתרן (חיובי).
246
השפעת ה SDS על החלבונים;
1) דטרגנט חזק שעושה דה נטורציה של החלבון , העצם הורס **מבנה מרחבי של החלבון** ובכך את תפקודו. ובעצם אחרי טיפול ב SDS , חלבונים גלובולריים נפתחים ונהיים ישרים למדי (מלבד קשרים דיסולפידיים שלא מושפעים) , כך בעצם ניטרלנו במידה מסויימת את צורת החלבון הנאטיבית (גלובולרי לעומת סיבי) ואת השפעתה על תנועתו בג׳ל.
2) הדטרגנט מפרק את האינטראקציות **הלא קוולנטיות** המייצבות מבנה שניוני , שלישוני ורביעוני של החלבון. כך שאם החלבון מורכב ממספר תת יחידות הם יתפרקו , וכל תת יחידה מופיעה בג׳ל כפס נפרד.
3) הוא נקשר לאזורים הידרופוביים בחלבון דרך ה back bone הפחמימני שלו , ולכן למטען ההתחלתי (הנאטיבי) של החלבון אין השפעה על האפיניות בין הדטרגנט לחלבון עצמו , כי הקישור אינו אלקטרו סטטי
4) מעניק לכל חלבון יחס מטען-מסה דומה , ובכך עושה סטנדרטיזציה בין החלבונים
247
בג׳ל אלקטרופורזה חלבונים יכולים לנוע באופן אקראי לפי המשקל המולקולרי שלהם ?
נכון / לא נכון
לא נכון.
בגלל תכונותיו של הפולי אקריל אמיד , כל תנועה של החלבונים אינה מתאפשרת , מלבד זו שנוצרת ע״י השדה החשמלי. כלומר כל עוד לא הפעלתי את השדה , לא תהיה נדידה של חלבונים.
248
בשיטות לחקר חלבונים בהם נצטרך לשבור קשרים דיסולפידיים , כיצד ניתן לעשות זאת ?
בעזרת החומר המחזר בטא מרקפטו אתנול
β - mercaptoethanol
249
שאלה של רן
250
גרף log M כתלות ״במרחק נדידה יחסי״:
גרף לינארי שלפיו ניתן לחשב מסה מולקולרית של חלבון לפי מרחק הנדידה שלו.
בעצם אני מריץ בבארית השמאלית חלבונים בעלי Mr ידוע , וכך אני מגדיר עבור כל מרחק נדידה של החלבון מסה בהתאם. אם המרחק שחלבון עבר אינו נעצר בדיוק ליד band שאני יודע , ניתן לפי הגרף להעריך את גודלו
שקף 215
251
בתום האלקטרופורזה , כיצד ניתן לראות לאן החלבונים הגיעו ?
בעזרת החומר comassie blue הנקשר לחלבונים אך לא לג׳ל עצמו. כעובי ה band כך נדע שיש שם יותר חלבונים.
ניתן במקום הקומאסי בלו להשתמש באיזוטופים רדיואקטיביים.
252
מה ניתן ללמוד דרך אלקטרופורזיס בג’ל ?
1) כמות ומספר החלבונים השונים בתערובת , כל band מדגים חלבון אחר (או תת יחידה בחלבון)
2) מידת הניקיון של של דגימת חלבון נתונה , אם יש לי המון bands משמע לא נקי , אם יש לי מיט bands משמע נקי.
3) הנקודה האיזואלקטרית של חלבון
4) משקלו המולקולרי של חלבון
253
כיצד אני יכול להשפיע על נדידת החלבונים בג׳ל אלקטרופורזה ?
על ידי משחק עם צפיפות הג׳ל , ככל שהג׳ל צפוף יותר , כך רק חלבונים קטנים יותר ויותר יצליחו לנוע בתוכו .
254
מהי אלקטרודה ?
מורכבת משני קטבים , קטודה ואנודה:
**אנודה**: זהו הקוטב החיובי ,
מתרחשים בו תהליכי **חמצון.** צורון כלשהו מאבד אלקטרונים ואלה נעים לכיוון הקטודה. אניונים נעים ליכוון האנודה
**קטודה**: זהו הקוטב השלילי ,
מתרחשים בו תהליכי **חיזור**. צורון כלשהו מקבל אלקטרונים שהגיעו מהאנודה.
אניונים נעים לכיוון הקטודה.
לוודא שזה נכון
255
מיקוד איזואלקטרי:
מיקוד איזואלקטרי isoelectric focusing הינו תהליך שבו ניתן לקבוע את הנקודה האיזואלקטרית של חלבון, וכן להפריד חלבונים על סמך נקודה זו.
מיקוד איזואלקטרי נעשה בשיטת אלקטרופורזה בג׳ל , עם תוספות קטנות:
- ג׳ל אלקטרופורטי דרכו החלבונים נעים , רק שאין פה גרדיינט של צפיפות
- שדה חשמלי שמניע את תנועת החלבונים
- גרדיינט pH
**במיקוד איזוטלקטרי אין שימוש ב SDS** כי יש חשיבות למטען הנאטיבי של החלבון
256
כיצד פועל מיקוד איזואלקטרי בשיטת האלקטרופורזה ?
1) **אנחנו יוצרים גרדיינט pH**
בעצם באזור העליון של הג׳ל , היכן שממוקמת הקטודה , ישנו קוטב שלילי ולכן ריכוז פרוטונים גבוה (**pH נמוך**). ובחלק התחתון של הג׳ל , היכן שממוקמת האנודה , יש ריכוז OH גבוה ומעט פרוטונים (**pH גבוה**).
2) נכניס את החלבונים לג׳ל , הם ינועו כעת עד שיגיעו לאזור שבו ה pH מתאים ל PI שלהם , כלומר לאזור שבו על החלבון נטו אין מטען **והחלבון אינו מסיס**
- גרדיינט הפרוטונים הינו קבוע (בגלל צכונות הג׳ל?)
- לא משנה היכן נשים את החלבונים , בסוף הם ינועו עד שמגיעים ל PI שלהם
257
מיקוד איזואלקטרי
כיצד נוצר גרדיינט ה pH בג׳ל ?
בעצם רק לאחר הפעלת השדה החשמלי ,
הפרוטונים ינועו לכיוון הקטודה , ויוני ההדרוקסיד לכיוון האנודה , וכך למעשה נוצר גרדיינט pH.
258
שלבי המיקוד האיזואלקטרי:
1) הפעלת השדה החשמלי ויצירת גרדיינט pH
2) מכבים את השדה החשמלי ומכניסים את החלבונים
3) מפעילים מחדש את השדה החשמלי , העקבותיו החלבונים ינועו עד לאזור pH בו מתקיים pH = PI
4) נכניס צבע , ונראה את אופן פיזור החלבונים בהתאם לערעי ה pH לפי הנקודה האיזואלקטרית שלהם.
259
ג׳ל אלקטרופורזה דו מימדי:
שילוב של מיקוד איזואלקטרי + SDS-PAGE
התהליך נעשה בסדר קבוע:
- קודם מיקוד איזואלקטרי
- שלב שני SDS-PAGE
ניתן בשיטה זו גם להפריד חלבונים וגם לכמת אותם.
מגבלה: חלבונים בעלי אותו משקל מולקולרי ואותה נקודה איזואלקטרית לא ניתנחם להפרדה בשיטה זו.
260
מדוע ג׳ל אלקטרופורזה דו מימדי נקרא כך ?
כי ההפרדה מתרחשת בשני מימדים:
- מימד הוריזונטלי (אופקי): הפרדה לפי מיקוד איזואלקטרי , בעצם לפי גרדיינט pH
- מימד וירטיקלי (אנכי): הםרדה לפי SDS-PAGE
ניתן בשיטה זו להפריד אלפי חלבונים.
261
ריצוף חלבונים:
שקף 220:
אנסולין של פרה , מורכב משתי שרשראות הקשורות בינהם בשני גדרים דיסולפידיים , שרשרת A ושרשרת B.
בתוך שרשרת B יש קשר דיסולפידי בין שני ציסטאינים במרחק 4 עמדות זו מזו
שרשרת A זהה גם אצל בני אדם
262
שיטת סנגר:
שיטה לריצוף חלבונים , במקור שימשה לריצוף אנסולין
263
שיטת אדמן:
שיטה לריצוף חלבונים , שיטה שמתבססת על **סימון וזיהוי החומצה האמינית בקצה האמינו טרמינלי של החלבון**.
ז״א חותכים את הפפטיד one amino acid at a time מהקצה האמיני , ומזהים את החומצות שמתקבלות , כך קובעים את רצף חומצות האמינו של החלבון שלב אחר שלב
השיטה עובדת בשני שלבים:
1) סימון הקצה האמיני של החלבון בעזרת המולקולה PITC , התהליך **מתרחש בתנאים בסיסיים מבוקרים**.
2) הידרוליזה חומצית , בעזרת החומצה anhydrous trifluoracetic acid **בתנאים חומציים**
264
PTH-amino acid
PTH=Phenylthiohydantoin
תוצר ביניים שמתקבל בעת ריצוף חלבון בשיטת אדמן. בעצם כאשר מתרחשת הידרוליזה חומצית , חומצת האמינו שבקצה ה N-טרמינלי בחלבון מתנתקת בעודה מחוברת ל PITC , הצורון הזה נקרא PTH-amino acid
לפי השם של הצורון , **תיו** , מלמד שיש קבוצת גופרית במבנה (מגיעה מ PITC).
265
כיצד ניתן לשלוט במערכת בשיטת אדמן ?
לפי חומציות הסביבה , בתנאים בסיסיים ה PITC מתחבר לפפטיד , בתנאים חומציים מתנתק.
כמו כן השליטה בחומציות הסביבה מאפשרת לכל שלב להתרחש עד תום בטרם התחיל השלב השני.
266
כיצד מזהים איזה חומצת אמינו התנתקה מהפפטיד ?
על ידי הכנסת הצורון PTH-amino acid לתמיסה אורגנית + שימוש בשיטת כרומטוגרפיה (קולונה)
מקרינים את הצורון האור אולטרה סגול כנגד מסך פלורוסנטי. ולפי רמת הבליעה של האור מזהים מי זאת.
דגרדציית אדמן ניתן לבצע עד 40 חומצות אמינו.
267
ריצוף חלבונים ע״י חיתוך:
1) שימוש בפרוטאזות: פרוטאזות הם אנזימים שחותכים חלבונים בריאציה **הידרוליטית**. חלקם ספיציפיים וחותכים קשר פפטידי רק בסמוך לשייר מסויים , וחלקם אינם ספיציפיים.
המאפיין של פרוטאזות ספיציפיות הוא שניתן לצפות מראש את אורך המקטעים שהולכים להתקבל.
2) ריאגנטים כימיים שיודעים לחתוך חלבונים בסמוך לשייר ספיציפי של חומצות אמינו
268
שיטות לקבוע את מבנה החלבון:
- x ray diffraction
- nuclear magnetic resonance NMR
המשותף לשתי השיטות זה שבשתיהן ניתן להפיק תמונה תלת מימדית של החלבון
269
דפרקציית קרני X
בשיטה זו החלבון חייב חהיות במצב גבישי , כלומר אחר קריסטלוגרפיה.
השיטה זו אנחנו מייצרים תמונת 3D של החלבון ע״י מיפוי של צפיפות האלקטרונים
אזורים בהם יש תפיפות אלקטרונית גבוהה מלמדים ששם שוכן הגרעין של אטום כלשהו (אם כך גם ניתן ללמוד על ה van der vals radiuses של אטומים
270
כיצד גפרקציית קרני X פועלת ?
1) נקח חלבון שנמצא **במצב גבישי** , ונקרין עליו קרני רנטגן. מרבית הקרניים יעברו דרכו , אך חלק מהם יתנגשו באלקטרונים ויוסטו (דפרקציה).
2) מאחורי החלבון שמים גלאי , על הגלאי יווצרו **תבניות קבועות** של ״כתמים״ , נקראים reflections או השתקפויות , אלא הם בעצם קרני הרנטגן שהוסתו
מבנה גבישי של חלבון הוא מבנה מסודר , ולכן ההשתקפויות (שנוצרות מהדפרקציות) על הגלאי יהיו בעלות דפוס קבוע וחזרתי.
4) כעת נמיר את ההשתקפויות ל electron density map בעזרת שיטת fourier transform
5) בשלב האחרון נבנה מודל של החלבון בהסתמך על המידע שיש לנו
271
מה ניתן ללמוד על חלבון דרך דפרקציית קרני X ?
1) מיקום אטומי המולקולה במרחב
2) המרחק בין האטומים השונים של המולקולה
3) המבנה התלת מימדי של חלבונים ומגה קומפלקסים כגון ריבוזום.
272
למה שיטה כמו דפרקציית X שימושית לפענוח מבנה של חלבונים ?
הודות לאורך הגל של קרני רנטגן , לקרני רנטגן יש אורך גל של 0.7-1.5 אנגסטרום , וזה מאפשר לנו לנתח מבנים מולקולריים קטנים כגון חלבונים
273
חסרונות שיטת הדפרקציה דרך קרני X:
1) דורשת השקעה רבה ואורכת שנים , בעצם השיטה מתבססת על ניסוי וטעיה עד להשכת המבנה הגבישי של החלבון.
2) חלבונים מסויימים אינם ניתנים לגיבוש , ועל כן לא ניתן לקבוע את המבנה שלהם בשיטה זו
3) הסביבה הפיזית בגביש **אינה זהה** לזו שבתמיסה או בתא חי
4) הקריסטל מקבע את מבנה החלבון , ולכן השיטה **מלמדת האופן מועט** על תנועות תוך מולקולריות בחלבון , כגון שינויי **קונפורמציה**.
274
יתרונות שיטת הדפרקציה בקרני x
X ray diffraction
1) המבנה הגבישי מייצג כמעט תמיד את המבנה הפונקציונלי של חלבון. ולכן השיטה מלמד על הקונפורמציה התפקודית של החלבון
2) ניתן בעזרתה לפענח מבנים של חלבונים גדולים , שלא ניתן לפענח את המבנה שלהם דרך NMR
275
NMR:
nuclear magnetic resonance
שיטה שקובעת את המבנה התחת מרחבי של חלבונים , ומולקולות קטנות.
**בתמיסה מימית** מופעל שדה מגנטי שמסיט את הספין של אטומים מסויימים. בהפסקת השדה , האטומים חוזרים לספין המקורי , שעקב כך הם פולטים **קרינת רדיו בתהודה חוזרת** , ניתן לרשום את הקרינה הזאת.
האטומים המושפעים מהשדה המגנטי , ובתוך כך חיוניים ל NMR הם H, C, N, F כשאטום המימן הוא הכי חשוב מבינהם
276
אטום המימן ו NMR:
בגלל הרגישות הגבוהה שלו , ושכיחותו הרבה במולקולות אורגניות , לרבות חלבונים , הוא בעל חשיבות מירבית בפענוח מבנים תלת מימדיים של חלבונים בשיטת NMR.
ככל שהמימנמם יותר קרובים אחד לשני במבנה החלבון , התהודה החוזרת שלהם תהיה יותר צפופה.
277
כיצד מפענחים את המידע המתקבל ב NMR?
ב NMR מתקבל **ספקטרון דו מימדי** , שלפיו ניתן להבדיל בין אטומים סמוכים (רזולוציה) , וכן הוא מכיל מידע על הסביבה הכימית של כל אטום. את המידע הזה אנחנו משווים עם המידע שקיים אצלנו אודות מבנה המולקולה על סמך המבנה הראשוני שלה - רצף חומצות אמינו , זוויות דיהדרליות וכו׳ , ורואים אם המידע תואם.
ב NMR יכול להתקבל ספקטרום חד מימדי , אולם הוא מסובך מדי לפענוח , רק בקבלת ספקטרום דו מימדי יהיה ניתן לפענח מבנה של חלבון.
278
מהם יתרונות השיטה ב NMR ?
1) ניתן לבצע אותה על מולקולות בתמיסה , בניגוד לדפרקציית קרני X שדורשת קריסטלוגרפיה של החלבון לפני כן , ולכן אם החלבון אינו מתגבש עדיין נוכל לפעמח את המבנה שלו ב NMR
2) נוכל לעקוב אחר השינויים המבניים שחלים בחלבון לאורך זמן , כגון שינויי קונפורמציה ואינטראקציות עם מולקולות אחרות
3) אינו ספיציפי לחלבונים , מאפשר פענוח מבנה של דנא וסוכרים
279
חסרונות ה NMR ?
1) מתאים לחלבונים קטנים יחסית , בין 80 ל 100 קילו דלטון , אם החלבון גדול יותר הרזולוציה תרד.
2) בגלל חשיבותו הרבה של המימן , מוחקולה שאינה מכילה מימן לא יהיה ניתן לפענח את המבנה שלה.
280
מה אנחנו מקבלים מחמצון של כוהל
בעצם בכוהל הפחמן קשור לחמצן אחד, כאשר מחמצנים אותו ישנם 3 אפשרויות:
- קבלת אלדהיד R-CH=O
- קבלת קטון R-CO-R’
- קבלת אתר R-O-R’
281
Carbonic anhydrase:
Metalloprotein
282
כיצד ויטמין C מונע היווצרות צפדינה ?
חומצה אסקורבית (ויטמין C) מחזרת את האנזים פרוליל 4 הידרוקסילאז , שממיר פרולין ל 4רהידרוקסי פרולין , חוממה אמינית זו חיונית למבנה תקין של קולגן.
האנזים פרוליל 4 הידרוקסילאז מכיל טבעת heme , שבמהלך ההידרוקסילציה של הפרולין הברזל מחומצן ומאבד אלקטרון , והופך להיות Fe +3 לא פעיל. חומצה אסקורבית מחזרת אותו חזרה ל 2+ פעיל.
