2-Observations microscopiques des microorganismes

Question 1

Quels sont les 2 grands types de microscopes?

Answer 1

Photoniques et électroniques

Question 2

Quel est l’autre nom pour les microscopes photoniques?

Answer 2

Microscopes optiques

Question 3

Quelle est la différence majeure entre un microscope électronique et un microscope photonique?

Answer 3

Électronique : utilise les électrons
Photonique : utilise les photons

Question 4

Quel est le grossissement maximal d’un microscope photonique?

Answer 4

x3000

Permet d’observer des microorganismes relativement grands

Question 5

Quelles sont les 3 composantes d’un microscope photonique?

Answer 5

• Condensateur : modifie les faisceaux lumineux (entre la source lumineuse et l’échantillon)
• Objectif : agrandit l’image
• Oculaire : agrandit l’image une deuxième fois

Question 6

Quels sont les 2 facteurs limitants d’observation au microscope photonique?

Answer 6

• Limite de résolution
• Contraste : capacité de distinguer une structure de son environnement

Question 7

Quelle est la formule pour calculer la limite de résolution?

Answer 7

LR=λ/(2η sin⁡θ )

λ : longueur d’onde
η : indice de réfraction du milieu
θ : ½ angle du cône de lumière entrant dans l’objectif
η sin⁡θ (Ouverture numérique NA) indiqué sur l’objectif

Question 8

Quels sont les facteurs sur lesquels on peut intervenir pour diminuer la limite de résolution? (3)

Answer 8

• Longueur d’onde λ
  Verre opaque aux UV, mais possibilité d’installer du quartz (Coûteux) et UV dangereux pour les yeux
• Indice de réfraction du milieu η
  Huile à immersion (η = 1,56) diminue la déviation de la lumière et évite changement de milieu verre-air-verre (Utilisée pour les objectifs à fort grossissement : 60-100x)
• ½ angle du cône de lumière entrant dans l’objectif θ

Question 9

Nommez 5 types de microscopes photoniques

Answer 9

• Microscope à fond clair
• Microscope à fond noir
• Microscope à contraste de phase
• Microscope à contraste d’interférence différentielle
• Microscope à (épi)fluorescence

Question 10

Que signifie une préparation à l’état frais et que permet-elle d’observer sous un microscope?

Answer 10

Cellules vivantes non transformées (pas de colorations, etc.)

Permet d’observer :
- Morphologie
- Motilité (déplacement) chez les protozoaires (pas chez les bactéries)
- Axe de division cellulaire (protozoaires)
- Corps d’inclusion cytoplasmiques chez les microorganismes de grande taille

Question 11

Quel est l’inconvénient d’utiliser une préparation à l’état frais?

Answer 11

Diminution du contraste

Question 12

Vrai ou faux
Les colorants tuent systématiquement la cellule

Answer 12

Faux
Peu de colorants sont vitaux, mais certains le sont

Question 13

Comment agissent les colorants lors d’une coloration? (2 possibilités)

Answer 13

Agissent selon la charge +/- (majorité des microorganismes sont -) ou hydrophobicité

Question 14

Qu’est ce qu’une coloration simple? Nommez un exemple.

Answer 14

Utilisation d’un seul colorant

Ex : Bleu de méthylène (+) se lie aux microorganismes (-)

Question 15

Nommez 2 exemples de coloration différentielle.

Answer 15

Coloration de Gram et Alcoolo-acido-résistance (AAR)

Question 16

Quelles sont les 4 étapes d’une coloration de Gram et quel va être le résultat à chaque étape?

Answer 16

1. Ajout de violet de cristal (tout est violet)
2. Ajout d’iode (mordant : fixe le violet de cristal s’il y a eu interaction)
3. Ajout d’alcool (Décolorant : perte du violet chez les Gram-)
4. Ajout de safranine (Contre-colorant : Gram + violet, Gram- rouge)

Question 17

Qu’est ce que l’AAR?

Answer 17

Alcoolo-acido-résistance
Identifie les mycobactéries en retenant le carbol-fuchsine sur l’acide mycolique

Question 18

Quelles structures peut-on observer avec une coloration différentielle?

Answer 18

• Endospores : organes de résistance
• Capsule : protège contre les infections
• Flagelle : motilité (taille inférieure à la limite de résolution classique)
• Corps d’inclusion : structure à l’intérieur du cytoplasme, réserve de C, N, P ou S

Question 19

Comment apparaît l’image avec un microscope à fond noir?

Answer 19

Structures claires sur fond noir

Question 20

Quelle est la différence matérielle entre un microscope à fond clair et un microscope à fond noir?

Answer 20

condensateur
- Cône de Abbe + miroirs crée un éclairage oblique
- Visualisation des rayons déviés (s’il n’y a rien : image noire)

Question 21

Citez 2 avantages à observer avec un microscope à fond noir plutôt qu’avec un microscope à fond clair.

Answer 21

• Permet de visualiser les structures sans coloration ni fixation (cellules vivantes)
• Permet de voir les noyaux

Question 22

Qui a inventé le microscope à contraste de phase?

Answer 22

Zernike

Question 23

Comment fonctionne un microscope à contraste de phase?

Answer 23

Anneaux de phase (mise en phase de la lumière incidente)

Réfraction lumière par structure cellulaire = changement phase lumière = Changement intensité

Microscope traduit changements de phase par des changements d’intensité lumineuse

Question 24

Comment apparaît l’image avec un microscope à contraste de phase?

Answer 24

Images sombres sur fond clair et formation d’un halo autour des cellules

Question 25

Qui a inventé le microscope à contraste d'interférence différentielle?

Answer 25

Normaski

Question 26

Comment fonctionne un microscope à contraste d'interférence différentielle?

Answer 26

Modification de la polarisation selon la réfraction Système de lentilles polarisantes contrôlées par informatique

Question 27

Qu'est ce que la polarisation?

Answer 27

Orientation des oscillations lumineuses

Question 28

Comment apparaît l'image avec un microscope à contraste d'interférence différentielle?

Answer 28

Même visuel que le contraste de phase, mais sans halo et en pseudo 3D

Question 29

Quel est le problème avec l'utilisation d'un microscope à contraste d'interférence différentielle?

Answer 29

Préparations doivent être transparentes

Question 30

Quels types de microscopes regroupe un microscope moyen de gamme? Comment le faire passer d'un type de microscopie à l'autre?

Answer 30

Regroupe fond clair, fond noir et contraste de phase dans le même instrument Condensateur mobile pour passer d’un type de microscope à l’autre

Question 31

Comment fonctionne un microscope à (épi)fluorescence?

Answer 31

1. Colorants fluorescents (fluorochromes) ajoutés à la préparation 2. Lampe UV vient exciter les électrons périphériques du colorant (lorsqu’ils reviennent à l’état stable : émission d’un photon visible) 3. Miroir dichroïque en verre va réfléchir les UV sur l’échantillon 4. La lumière visible va traverser le verre (UV ne passe pas)

Question 32

Quelle est la différence entre un microscope à épifluorescence et un microscope à fluorescence?

Answer 32

Fluorescence : source de lumière sous l'échantillon (+ dangereux) Épifluorescence : source de lumière au dessus de l'échantillon

Question 33

Quel est le principal avantage de la microscopie à fluorescence?

Answer 33

Fluorochromes sont vitaux Permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes : - Cellules vivantes : exclusion par la membrane cytoplasmique - Cellules mortes : membrane cytoplasmique perméable Limite : cellule peut parfois être de 2 couleurs (ex : est en train de mourir)

Question 34

Expliquez l'immunofluorescence en utilisant la microscopie à fluorescence.

Answer 34

Utilisation d’anticorps couplé à un fluorochrome Anticorps va se lier à la protéine/organisme d’intérêt

Question 35

Expliquez en quoi consiste le FISH

Answer 35

Utilisation de sondes d’ADN spécifique préalablement couplée à un fluorochrome Sonde d’ADN va s’appareiller si brin d’ADN complémentaire présent

Question 36

En quelle année le microscope électronique a-t-il été découvert?

Answer 36

1931

Question 37

Quelle est la capacité de grossissement maximale d'un microscope électronique?

Answer 37

Grossissement de 100 000 à 1 000 000x

Question 38

Pourquoi le microscope électronique permet-il d'observer des structures plus petites?

Answer 38

Longueur d'onde des électrons est plus courte que celle des photons

Question 39

Expliquez le fonctionnement général d'un microscope électronique

Answer 39

- Utilisation d’électro-aimants (pas de verre : bloque les électrons) - Bombardement d’électrons sur l’échantillon - Électro-aimants focalisent les électrons et les envoient sur une plaque électrosensible - Image de la plaque est convertie en image visible par un ordinateur

Question 40

Nommez 4 techniques de préparation (coloration) pour l'utilisation sous microscope électronique et expliquez-les brièvement.

Answer 40

- Technique d'ombrage (shadow casting) Vaporisation de métaux selon un angle précis pour recouvrir l’échantillon Relief de l’échantillon révèle une ombre Métal se dépose sur les bosses, les creux seront donc plus clairs - Coloration négative Utilisation d’acide phosphotungstique S’accumule dans les creux (sombres) et les protubérances vont être claires - Cryodécapage (freeze etching/fracture) Congélation de l’échantillon à une température inférieure à -180ºC et coupe transversale de l’échantillon Fractures aux zones de faiblesse Réalisation d’une technique d’ombrage par la suite - Immunolocalisation cellulaire Utilisation d’anticorps spécifiques à une protéine/structure Anticorps couplés à des billes de fer ou d’argent

Question 41

Nommez 2 types de microscopes électroniques et expliquez brièvement leur fonctionnement.

Answer 41

- Microscope électronique à transmission Électrons traversent l’échantillon Détecteur sous l’échantillon recueille les électrons Image par transparence (nécessite structures très fines) - Microscope électronique à balayage Balayage de la surface de l’échantillon Électrons sont réfléchis et un détecteur latéral permet de les détecter Donne un effet 3D Images un peu moins agrandies qu’un microscope électronique à transmission

Question 42

Comment réaliser une cryoélectromicroscopie/cryotomographie électronique?

Answer 42

Congélation rapide à -135ºC avec éthane et N2 liquide Vitrification de l’eau permet de conserver l’intégrité des structures sous vide Permet la modélisation des structures protéiques Tomographie : image de strates de l’échantillon sans production de coupes Reconstruction informatique 3D

Question 43

Vrai ou faux Le microscope confocal à balayage laser est un microscope électronique.

Answer 43

Faux (microscope photonique)

Question 44

Expliquez le principe du microscope confocal à balayage laser.

Answer 44

Illumination par laser UV (utilisation de fluorochromes) Détection de la fluorescence exclusivement du plan du foyer Balayage du laser : horizontal, vertical et temporel Numérisation de l’image et reconstitution informatique en 3D (4D en temporel)

Question 45

Nommez 2 types de microscopes à balayage de sonde

Answer 45

Microscope à effet tunnel et microscope à force atomique

Question 46

Expliquez le fonctionnement du microscope à effet tunnel.

Answer 46

Sonde balaie la surface et mesure le déplacement vertical/horizontal et le courant entre les nuages électroniques

Question 47

Expliquez le fonctionnement du microscope à force atomique

Answer 47

Déplace la sonde en maintenant constante la distance entre la pointe de la sonde et la surface (légère force exercée sur la pointe pour maintenir la distance sans endommager l’échantillon) Mesure de la déflexion par un laser en suivant le mouvement vertical de la pointe (relief)

Question 48

Quel est l'avantage d'utiliser un microscope à force atomique par rapport à un microscope à effet tunnel?

Answer 48

Peut étudier les surfaces qui ne conduisent pas bien l’électricité