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TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire > 2. Transcriptomique + Protéomique > Flashcards

2. Transcriptomique + Protéomique Flashcards

1
Q

Définissez Transcriptomique :

A

Étude de l’expression des gènes à un moment précis dans une cellule, donc l’étude de tous les ARN présents dans la cellule à un moment précis.

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2
Q

Qu’est-ce que le Buvardage Northern ?

A

Principe : Séparation des ARN en fonction de leurs tailles par électrophorèse en gel d’agarose dénaturant. Le formaldéhyde sert à dénaturer les structures secondaires et éviter les appariements intra-moléculaires. Un transfert sur une membrane sera effectuée (fixation d’ARN), hybridation d’une sonde marquée au fluorophore, lavages et révélation du signal.

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3
Q

Qu’est-ce que permet le Buvardage Northern (2) ?

A
  1. Quantification de L’ARN
    - Sonde nécessaire pour un gène d’intérêt
    - Sonde témoin (dont l,expression est connue/constante)
  2. Déterminer la tailles des transcrits
    - Marqueur moléculaire d’ARN pré-marqué (visualisation possible sur un auto-radiogramme)
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4
Q

Pourquoi la technique d’appelle Buvardage northern ?

A

Par ce que le nom du découvreur de la technique avec de l’ADN = Southern
Donc puisque c’est le même principe, mais avec de l’ARN = Northern

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5
Q

Quelles sont en gros les étapes de la technique Buvardage northern ?

A
  1. Séparation des molécules d’ARN en fonction de leurs tailles (200-500 pb) sur un gel d’électrophorèse. Utilisation d’un gel d’agarose dénaturant (formaldéhyde = dénature les structures secondaires de l’ARN)
  2. Transfert sur membrane : filtre par capillarité absorbe l’eau, le papier va absorber = migration des échantillons vers la membrane
  3. Hybridation à l’aide d’une sonde marquée produire par PCR (ADN) ou par transcription in vitro (ARN) (fluorophore ou composé chimique)
  4. Révélation sur un film qui va être brulé à l’endroit spécifique
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6
Q

Quels sont les points critiques de la technique Buvardage northern ?

A
  1. Éviter la dégradation des ARN (ARNase sont partout !!!)
  2. T° d’hybridation des sondes (typique ~60°C, importante pour l’hybridation spécifique et pour diminuer les interactions non-spécifiques)
  3. Bon lavages stringent (important pour la spécificité requise)
    - Détergents (SDS, triton)
    - Agents dénaturants (Formamide)
    - Sels: favorisent l’hybridation non-spécifique (moins de sel = plus forte stringence)
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7
Q
  1. Qu’est-ce qu’on veut dire quand il y a une stringence élevée ?
  2. Qu’est-ce qu’on veut dire quand il y a une faible stringence ?
A
  1. Hybridation avec une cible parfaitement complémentaire (stringence élevée)-
  2. Hybridation avec une cible qui n’est pas parfaitement complémentaire (faible stringence)
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8
Q

Qu’est-ce que veut dire PCR ?

A

Polymerase Chain Reaction

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9
Q

En quoi consiste la PCR

A

C’est une réaction d’amplification exponentielle d’un fragment d’ADN/ARN spécifique.

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10
Q

Vrai ou faux PCR

  1. La vitesse d’amplification dépend de la quantité d’ADN/ARN du départ
  2. Plus il y a de matériel au départ et plus le nombre de cycle nécessaire sera grand
  3. Il est possible d’estimer la quantité d’ADN de départ en analysant la vitesse d’amplification
A
  1. Vrai
  2. Faux, moins de cycle nécessaire si plus d’ADN/ARN au départ
  3. Vrai
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11
Q

Que signifie RT-qPCR ?

A

C’est la Reverse Transcriptase quantitative PCR.

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12
Q

En quoi consiste la RT-qPCR ?

A
  • ARN comme matériel de départ
  • ARN converti en ADNc
  • ADNc utilisé comme matrice pour une rx de PCR quantitative (détection en temps réel de la fluorescence)
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13
Q

Nommez les trois stratégies pour la création d’ADNc par transcription inverse

A
  1. Amorce spécifique
  2. Amorces aléatoire
  3. Amorces poly-dT
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14
Q

Expliquez la stratégie d’amorces spécifiques pour la création d’ADNc par transcription inverse.

A
  • Utilisation d’une seule amorce spécifique au gène d’intérêt
  • Hybridation spécifique sur 1 transcrit = 1 seul gène converti ARN-> ADNc
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15
Q
  1. Expliquez la stratégie d’amorces aléatoires pour la création d’ADNc par transcription inverse.
  2. Nommez les avantages
  3. Nommez 1 désavantage
A
    • Utilisation d’amorces aléatoires
    • Tous les ARN seront convertis en ADNc (avec différentes amorces)
    • Chaque amorce a une séquence spécifique, mais la collection d’amorces est variée.
    • L’utilisation d’amorces variées permet d’avoir de la complémentarité avec plusieurs ARN. Cela permet de bien représenter l’ensemble des ARN présents dans un échantillon.
    • Utile pour produire une banque d’ARN
  3. Pas spécifique. Couvre l’ensemble des ARN présents.
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16
Q
  1. Expliquez la stratégie d’amorces poly-dT pour la création d’ADNc par transcription inverse.
  2. Nommez l’avantage principal de cette méthode
  3. Nommez 1 désavanatge
A
    • Uniquement conversion des ARN polyadénylés
    • Convertis en ADNc à partir de leurs extrémités 3’
  2. Permet de sélectionner spécifiquement les ARNm, car c’est les seuls ARN avec une queue polyadénylée.
  3. Possible seulement chez les eucaryotes (pas de queues de poly-A chez les procaryotes)
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17
Q

Vrai ou faux RT-qPCR

  1. L’ADN est marqué par fluorescence en temps réel
  2. L’appareil, une fois la réaction terminé, peut lire l’abondance de la fluorescence.
A
  1. Vrai

2. Faux, en temps réel (caméra + laser)

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18
Q

Définissez ces termes de RT-qPCR

  1. Vitesse
  2. Seuil
  3. CT
A
  1. Nombre de cycle nécessaire pour atteindre quantité d’ADN pour pouvoir amplifier
  2. Abondance d’ADN à partir duquel on mesure un CT
  3. Abondance d’ADN qu’il y a dans un tube à un cycle précis.
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19
Q

Vrai ou faux RT-qPCR

Plus la quantité d’ADN au départ est élevée, moins le nombre de cycles nécessaires pour atteindre la phase exponentielle est élevé.

A

Vrai

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20
Q

Il existe plusieurs méthodes de quantification, dont la détection par émission de fluorescence. Nommez les 2 techniques.

A
  1. Colorant SYBR green I

2. Sondes Taqman

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21
Q

En quoi consiste la technique de détection apr émission de fluorescence du colorant SYBR green I ?

A

C’est un agent intercalant qui émet de la fluorescence lorsqu’il est associé à de l’ADN db. Une seule paire d’amorce à la fois, car pas de manière de distinguer 2 séquences différentes.

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22
Q

Quels sont les avantages de la méthode colorant SYBR green I ?

A
  1. Simple
  2. Peu coûteuse
  3. Non-spécifique (peu être utilisé pour n’importe quel gène).
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23
Q

Quels est le plus gros désavantages de la méthode colorant SYBR green I ?

A

Il peut être utilisé pour n’importe quel gène, ne différencie pas les amplicons cibles des produits non-spécifiques.

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24
Q

En quoi consiste la technique de détection apr émission de fluorescence du colorant sonde Taqman?

A
  • C’est une méthode spécifique à un gène qui dépend entièrement de l’activité exonucléase de la pol Taq qui permet de quantifier plusieurs ampliquons simultanément dans un même échantillon.
  • Un fluorophore est lié à l’extrémité 5’ des amorces spécifiques à la séquence cible, et un extincteur à l’autre extrémité.
  • Un fluorophore spécifique et différent est utilisé pour chaque séquences. Ça permet d’en utiliser plusieurs dans un échantillon.
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25
Q

Expliquez le fonctionnement d’une sonde Taqman

A
  • La sonde se lie à la séquence cible ( séquences complémentaires spécifiques)
  • L’amorce et la pol Taq se fixent. Polymérisation.
  • Lorsque la Taq pol va entre en contact avec la sonde, elle détachera le fluorophore grâce à son activité 5’ exo.
  • Plus il y a synthèse d’ADN spécifique dans le tube et plus il y aura relâchement de fluorophore et donc plus de fluorescence.
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26
Q

Qu’est-ce que permet entre autre la technique de sonde Taqman ?

A
  • Permet la détection de SNPs spécifiques (polymorphisme).
  • Cette technique permet de quantifier la présence des deux allèles.
  • On peut mélanger les deux types de sondes dans l’échantillon et mesurer la fluorescence associé à chacun des polymorphisme.
    Ex:
    vert = 1er type de polymorphisme
    Rouge = 2e type de polymorphisme
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27
Q

SYBR Green vs Taqman

  1. combien d’échantillon analysé à la fois ?
  2. Coût
  3. Contrôle/sensibilité
A

SYBR Green Taqman
1. 1 seul ADN / échantillon. Possibilité de multiplexage
2. Moins dispendieux. Amorces dispendieuse (fluorophore)
3. Plus de contrôle (courbe Meilleur sensibilité
De dissociation )

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28
Q

Pour quantifier de l’ADN par qPCR, 2 méthodes de quantification existe. Lesquelles ?

A
  1. Méthode relative

2. Méthode absolue

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29
Q

Expliquez la méthode relative pour quantifier de l’ADN par qPCR.

A

Méthode relative :

  • Permet de comparer l’abondance entre plusieurs échantillons.
  • Besoin de standards qui ne varient pas entre les différents échantillons (ex: gènes housekeeping)
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30
Q

Expliquez la méthode absolue pour quantifier de l’ADN par qPCR.

A

Méthode absolue:

  • Permet de déterminer l’abondance d’un ADN dans un échantillon, en concentration absolue.
  • Besoin de standards internes (ex: housekeeping genes)
  • Besoin d’une courbe standard avec un ADN de [ ] connue.
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31
Q

Si je me réfère à la méthode relative de quantification de L’ADN par qPCR, que signifie la différence de 1 cycle entre 2 échantillon ?

A

La différence de 1 cycle entre 2 échantillons signifie une différence (fold-change) de 2 fois en abondance relative !
Ex:
deltaCt = 2 = 4 fold-change

deltaCt = 3 = 8 fold-change

deltaCt = 4 = 16 fold-change

32
Q

La méthode relative de quantification de l’ADN par qPCR permet de calculer l’abondance relative d’un ADN donné entre 2 échantillons. Quelle est la formule ?

A

Voir diapo dans le pp ( impossible de mettre des exposant greeee )

33
Q

Nommez 2 avantages et 2 désavantages de la méthode absolue de quantification de l’ADN par qPCR.

A

Avantages:
1- Précis
2- Tien compte de l’efficacité de la rx de PCR

Désavantages:

  1. Plus de rx requises
  2. Risque de contamination par le standard
34
Q

RT-PCR: Contrôle critique (3 contrôle pour la RT-PCR au total)

  1. Pourquoi fait-on un contrôle critique ?
  2. Quel contrôle peut-on faire pour la pureté et l’intégrité de l’échantillon ?
  3. Pourquoi doit-on faire une rx de RT sans ajout de transcriptase inverse ?
A
  1. Le contrôle permet de s’assurer de la pureté et de l’intégrité de l’ARN amplifié.
  2. Pureté = DO260/280
    Intégrité = ratio ARNr 28S/18S sur gel , bactéries = 23S/16S
  3. La courbe d’amplification qu’on obtient provient de la fluorescence associé à l’abondance de l’ADN/ARN amplifié. La rx sans ajout permet de détecter une contamination d’ADN génomique
35
Q

Lors de la RT-PCR l’agent intercallant tel SYBR Green va s’associer de façon non spécifique avec les ADN db (même avec les dimères d’amorces et avec de l’ADN contaminant si présent). Pour s’assurer que l’amplification est bien spécifique, on va faire une courbe de dissociation.

Expliquer le principe de la courbe de dissociation (contrôle de la RT-PCR)

A

Courbe de dissociation:

On va augmenter la T° graduellement à coup de 0,5°C. Lorsqu’il y aura atteinte du Tm du produit spécifique de rx = chute drastique de la fluorescence (car T° à laquelle les molécules d’ADN db se dénaturent pour devenir sb).

  • Si 1 seul produit spécifique dans la réaction = 1 seule chute
  • Si produits contaminants présents = plus d’une chute !

La courbe permet de détecter des produits non-spécifiques.

36
Q

Expliquez en quoi consiste le contrôle critique pour valider/optimiser les amorces et les conditions de PCR

A
  • Mettre les amorces et la taille des produits obtenus sur gel.
  • Utiliser des amorces pour plusieurs gènes contrôles (expression ne varie pas dans les conditions expérimentales dans laquelle l’extrait a été isolé). Ça permet de normaliser l’expression des gènes d’intérêts.
  • Utiliser au moins 3 réplicas biologiques ou 2 réplicas techniques.
37
Q

Nommez les 3 contrôle pour la RT-PCR :

A
  1. Vérification de l’intégrité et de la pureté de l’extrait
  2. Faire une rx de RT sans ajout de transcriptase inverse et faire une courbe de dissociation pour les rx utilisant le SYBR green (permet de détecter les contaminants)
  3. Validation/optimisation des amorces et conditions de la PCR.
38
Q

Définir :

  • un réplicas technique
  • un réplicas biologique
A

Réplicas techniques: mesurer plusieurs fois le même échantillon. But : limiter la variation due à la mesure.

Réplicas biologiques, effectuer la rx sur plusieurs échantillons différents. But : limiter la variation due au processus d’échantillonnage lui-même.

39
Q

La technique de la puce à ADN et le séquençage d’ARN sont des techniques qui permettent quoi ?

A

Elles sont des techniques de quantification de l’expression des gènes. Permet de voir les gènes actifs et inactifs dans une condition donnée.

40
Q

Quelle est la différence entre les techniques de Buvardage Northern, PCR + RT-PCR Et les techniques de puces à ADN et séquençage d’ARN ?

A

Permettent de détecter l’abondance d’un petit échantillon d’ARN (1-2 à la fois)

  • Buvardage Northern
  • PCR + RT-PCR

Permettent de détecter l’entièreté des ARNm d’un échantillon donné.

  • puces à ADN
  • séquençage d’ARN
41
Q

Expliquez la puce à ADN :

A
  • Méthode peu coûteuse
  • Utilisation d’une lame de verre ou d’une microplaque
  • Attachement de sondes spécifiques pour des gènes spécifiques sur la lame
  • Extraction et marquage (fluorophore) d’ADNc de l’ARNm d’une espèce donnée
  • ARNm mis en contact avec la puce, si sonde correspondantes est présente = hybridation = fluorescence
42
Q

La collecte de données sur une puce à ADN est automatique. Quel est le principe de couleur ? Pourquoi y a-t-il plusieurs couleurs ?

A

Chaque fluorophore est propre à un échantillon précis. Si l’échantillon s’hybride à une sonde spécifique de la plaque = fluorescence

Échantillon A = rouge
Échantillon B = vert
Si la séquence est présente dans les deux échantillons = jaune ( rouge + vert)

Si aucune séquence ne correspond = noir (pas de fluorescence détectée)

43
Q

Qu’est-ce qui est primordiale dans la puce à ADN ?

A
  • Des conditions d’hybridation et de lavage stringentes (spécifique) sont primordiales.
44
Q

Quelle sont les limitations de la méthode puce à ADN ?

A
  1. Signal non-linéaire pour différentes abondances de molécules
  2. Impossible d’effectuer l’expérience avec des molécules dont la séquence demeure inconnue
45
Q

Méthode du séquençage d’ARN, quel est le principe ?

A

Principe : Convertir l’ARNm en ADNc à l’aide de la transcriptase inverse puis séquencer les molécules, puis aligner avec une séquence de génome référence

46
Q

Méthode du séquençage d’ARN permet 2 choses :

A
  1. Compter le nombre de copies de chaque gène/allèle

2. Permet de connaitre la structure (isoforme)

47
Q

Avec la méthode du séquençage d’ARN, il est possible de faire une méthode directionnelle. Qu’est-ce que ça permet ?

A
  1. Identifier des transcrits antisens

2. Meilleure précision dans la quantification

48
Q

Quelles sont les étapes de l’ARN-seq (séquençage d’ARN)

A
  1. Récolte d’échantillon (ARNtotal)
  2. Enlever les ARNr, isoler les ARNm
  3. Fragmenter les ARNm
  4. Ajout d’amorces spécifiques
  5. Faire des ARNc (transcription inverse)
  6. Création ADNdb, ajout adapteur en Y
  7. Création d’une banque d’ADNc
  8. Utiliser la banque d’ADNc sur une plateforme de séquençage connue (Illumina/ Ion Torrent)
  9. Cartographie des reads sur un génome de référence.
49
Q

pourquoi il est fortement recommandé d’éliminer les ARNr avante le séquençage avec la méthode de ARN-seq ?

A

Parce que les ARnr correspondent à ~95% des ARN de la cellule et seul 2% sont des ARNm. Afin d’avoir une amplification spécifique et voulue on élimine les ARNr.

50
Q

Quelles sont les 3 approches utilisées pour éviter d’avoir des ARNr dans le séquençage lors de la méthode ARN-seq ?

A
  1. Sélection des ARNm par queue poly-A pour RT (eucaryote seulement)
  2. Hybridation soustractive des ARNr
  3. Nucléase spécifique contre les molécules db
51
Q
  1. Éviter les ARNr par la méthode d’hybridation soustractive (lors de l’ARN-seq), décrivez en quoi consiste cette technique.
  2. Nommez les deux méthodes (compagnies)
A
  1. Utilisation de billes magnétiques avec des oligonucléotides complémentaires soit aux :
    - queues de poly-A (enlever le surnageant)
    - ARNr + ARN stables (garder surnageant)

L’utilisation de billes permet de mettre les cibles de côté et permet de garder les molécules désirées en solution.

    • MICROExpress
      • Ribo zero
52
Q

Déplétion d’ARNr par l’utilisation d’une nucléase spécifique aux molécules db (méthode ARN-seq), décrivez en quoi consiste cette technique.

A
  1. Conversion de l’ARNt en ADNc = banque d’ADN db complémentaire à l’ARNt
  2. Chauffer la banque d’ADNc = dénaturation des ADNc db = ADN sb
  3. Ajouter la nucléase db en diminuant lentement la T°. Les ADN les plus abondants dans l’échantillon vont s’hybrider plus rapidement. La nucléase va donc dégrader les ARNr plus rapidement que les ARNm.
  4. Arrêt de la rx à une T° quand meme élevée pour en pas détruire l’ADNc de l’ARNm.

= Banque d’ADNc normalisée avec une quantité enrichie en ARNm

53
Q

Est-ce que les trois méthodes servant à enrichir les ARNm pour la réaction d’ARN-seq sont toutes autant efficaces ?

A

Non !

Dans la méthode qui utilise une nucléase, il y a une grande variation d’efficacité en fx du contenu en G-C de la séquence.

54
Q

Comment fait-on pour représenter l’abondance d’un transcrit avec la méthode ARN-seq ?

A

Utiliser le FPKM (Fragments per Kilobase per Milion mapped reads)

55
Q

En quoi consiste le FPKM (Fragments per Kilobase per Milion mapped reads)?

A

Sert à normaliser la taille d’un gène et la profondeur de séquençage

(Parce que dans un expérience de ARN-seq, le nombre de fragments originant d’un transcrit est directement proportionnel à son expression relative. Cela pose un problème puisque les plus longs gènes vont générer bcp plus de fragments)

56
Q

Quelle est la formule du FPKM (Fragments per Kilobase per Milion mapped reads)?

A

(1x10^9 * C) / (L*N)

C = nombre de fragments alignés sur un gène/transcrit
L = Longueur (pb) de l’ARNm du gène/transcrit
N= nombre total de fragments alignés dans cette librairie
57
Q

Nommez les trois techniques pour analyser la structure des transcrits (après une technique de quantification par exemple)

A
  1. Identification des nouveaux ARN
  2. Jonctions d’épissage par ARN-seq
  3. Détection de fusions
58
Q

Avec la méthode du séquençage d’ARN, il est possible de faire une méthode directionnelle, quel serait le but ?

A
  1. Déterminer sur quel brin l’ARN était originalement transcrit (sens ou anti-sens)
  2. Permet de mieux quantifier la quantité de transcription
59
Q

Avec la méthode du séquençage d’ARN, il est possible de faire une méthode directionnelle, quelles sont les étapes ?

A
  1. Récolte d’échantillon (ARNtotal)
  2. Enlever les ARNr, isoler les ARNm
  3. Fragmenter les ARNm
  4. Incorporer des amorces ainsi que des dUTPs
  5. Faire des ARNc avec des amorces (transcription inverse = ARNm+ADNc)
  6. Création ADN db (brin complémentaire avec uracile), ajout adapteur en Y
  7. Élimination brin avec uracile
  8. Création d’une banque d’ADNc sb (1 seul sens = donne directionnalité de la rx)
  9. Utiliser la banque d’ADNc sb sur une plateforme de séquençage connue (Illumina/ Iron Torent)
  10. Cartographie des reads sur un génome de référence.
60
Q

Pourquoi est-ce important lors de l’ARN-seq avec directionnalité, de déterminer le sens du transcrit ?

A
  • Important pour distinguer d’où proviennent les reads (brin Creek ou Whatson)
  • C’est important puisque les ARNm anti-sens ne code pas pour une protéine.
61
Q

Quel rôle précis ont les ARNm anti-sens ?

A
  • Bloquer les expression sens ! Par exemple, dans une situation de défense, la cellule ne doit pas faire de méiose, alors pour éteindre les gènes de méiose, il y aura expression d’ARNm anti-sens qui vont bloquer l’expression de la méiose.

Seule manière de détecter les ARNm anti-sens c’est de faire une banque d’ARN-seq directionnelle.

62
Q

À quoi peut bien servir l’analyse des jonctions d’épissage par ARN-seq méthode directionelle?

A
  • Permet d’identifier les exons

- Permet l’épissage alternatif

63
Q

À quoi sert l’analyse de la fusion génique

A
  • Voir les anomalies causés par un assemblage de deux gènes provenant de 2 chromosomes différents = perte ou gain de fx.
  • Les ARNm auront fusionnés, possiblement les protéines produites aussi.
  • Facilement identifiable avec un séquençage paired-end ou par des longs reads
64
Q

Séquençage d’ARN direct : nommez les 2 méthodes et leurs caractéristiques

A
  1. Nanopore :
    - Direct sur ARN (longs reads ~100 kb)
    - Faible coût
    - Rapide
    - Moins de risque de biais
    - Taux d’erreur élevé ~15%
  2. Helicos
    - Immobilisation d’ARN sur une plaque
    - rx de transcription inverse
    - Détection de la fluorescence en temps réel (pas besoin d’amplification)
    - Reads courts (~35 pb)
    - Moins de biais puisque sans amplification
    - Taux d’erreur ~3%
65
Q

Qu,est-ce que la protéomique ?

A
  • Identifier et quantifier les protéines totales présentes dans un échantillon.
  • C’est une discipline qui s’intéresse à l’ensemble des protéines d’un échantillon.
66
Q

Qu’est-ce que la spectrophotométrie de masse ?

A

C’est une technique qui permet de mesurer la masse des protéines ou des peptides avec une grande précision ( Dalton près !)

L’identité (méthode LC-MS) et/ou la séquence (MS/MS) précise peut être déterminée en identifiant les séquences d’acides aminés concordant avec la masse détectée.

67
Q

Pour la spectrométrie de masse il existe plusieurs techniques d’ionisation et plusieurs techniques de détection. Nommez-les :

A

Techniques d’ionisation:

  • EI (electron ionisation)
  • FAB (fast atom bombardement)
  • ESI
  • MALDI

Technique de détection:

  • TOF (time of flight)
  • Q (quadrupole)
  • FT-ICR
68
Q

Il existe 2 méthodes distincte de spectrophotométrie de masse. Nommez-les et à quoi servent-elles précisément ?

A
  1. LC-MS : Identification de protéines

2. LC-MS/MS : Séquençage de protéines

69
Q

Expliquez la méthode 1. De spectrophotométrie de masse ( LC-MS : Identification de protéines )

A

LC-MS : Identification de protéines

  1. Extraction de protéines (faible quantité va mieux)
  2. Isolation de protéines individuelles (séparer l’échantillon) sur HPLC
  3. Digestion des protéines avec un peptidase (ex: Trypsine qui coupe à la lysine)
  4. Les protéines sont coupées de façon spécifique grâce à la peptidase
  5. Détermination de la masse spécifique (ratio masse-charge)
70
Q

Qu’est-ce que le PMF (Peptide Mass Fingerprinting)?

A

C’est une technique utilisée pour identifier des protéines. En digérant une protéine d’une façon connue (ex: trypsine), les fragments (et leurs masses) générés sont suffisamment uniques pour identifier la protéine d’origine.

  • Une comparaison entre le spectre de masse obtenue et le spectre de masse théorique on peut conclure la présence d’une protéine en particulier.
71
Q

À quoi doit-on faire attention avec la méthode du PMF ?

A

Masse des résidus acides aminés qui sont des isomères sont très difficiles à distinguer.

72
Q

Expliquez la méthode de spectrophotométrie de masse 2. (LC-MS/MS : Séquençage de protéines)

A
  1. Isoler un échantillon (extraction de protéines)
  2. Ionisation de l’échantillon ( méthode EI, ESI, MALDI)
  3. Digestion à la Trypsine ( Les protéines sont coupées de façon spécifique grâce àa la peptidase)
  4. Isolation des peptides individuels avec HPLC
  5. Détermination de la masse des fragments (ratio masse/charge)
    Jusqu’ici comme la méthode 1. LC-MS
  6. Déterminaiton de la séquence du peptide MS/MS
  7. Isolation des ions afin de connaitre l’ordre des ions présents
73
Q

Comment se passe la fragmentation des peptides-ions par collision dans la spectrophotométrie de masse LC-MS/MS (méthode 2) ?

A
  1. Utilisation d’un gaz pour effectuer une collision et briser les liens chimiques (liens covalents rompus)
  2. Les ions produits vont donner un spectre d’ions
  3. Peut créer deux séries de fragments d’ions, les beta et les gamma
  4. La fragmentation permet d’analyser les ions obtenus et d’associer la masse de l’ion avec un acide aminé précis
74
Q

Faire l’exercice pour identifier les peptides obtenus par digestion à la Trypsine puis séquencé par MS/MS.

A

Voir fin pp #2 et exercices

75
Q

La méthode MS peut se faire de façon relative ou absolue. Expliquez.

A

Méthode relative:

  • Normalisation par rapport aux autres protéines de l’échantillon (standards internes)
  • Comparaison d’une seule protéine entre plusieurs échantillons.

Méthode quantitative:

  • Mesure l’abondance réelle d’une protéine
  • Comparaison sur une courbe standard (extterne)
76
Q

Vrai ou faux
MS Méthode relative: marquage métabolique (SILAC)

  1. Sert à comparer l’abondance relative entre 2 échantillons
  2. Marquage avec 1 isotope
  3. Mélanger tissus/cellules/cultures, puis extraction, purification et LC-MS/MS
  4. On pourra distinguer les peptides identiques provenant de deux échantillons grâce à la différence de masse créer par les isotopes.
  5. Utilisation d’une courbe pour quantifier
  6. Il y aura apparition de 2 abondances métaboliques grâce à la différence de masse. Cela va permettre de réduire l’erreur expérimentale.
A
  1. Vrai
  2. faux ! 2 isotopes stables (ex: lourd et léger)
  3. Vrai
  4. Vrai (lourd vs léger)
  5. Vrai, aire sous la courbe
  6. Vrai

TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire (6 decks)

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