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TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire > 6. Manipulation génétique des eucaryotes > Flashcards

6. Manipulation génétique des eucaryotes Flashcards

1
Q

Définissez une culture cellulaire primaire, secondaire et immortelle

A
  1. Culture primaire :
    - Prélevée d’un tissus et maintenue en culture pour un certain temps
  2. Culture secondaire :
    - Division cellulaire in vitro, puis propagées (passage)
    - Passage : un pétri de cellules (souvent des fibroblastes) qui était saturé va être divisé en 3 autres pétris, sénescence après ~ 50 divisions cellulaires.
  3. Culture de cellules immortelles:
    - Issus de tumeurs de pt (c qui ont acquis la capacité de se diviser infiniment)
    - Croissance rapide ++
    - Résistantes à l’apoptose, donc elles peuvent devenir des modèles cellulaires (mais garder en tête que ces cellules ne sont pas tout à fait normal !!).
    - Ex: lignée HELA de Henrietta Lacks !
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Q

Quelles sont les 4 manières d’insérer de l’ADN dans des cellules eucaryotes, expliquez-les brièvement ?

A
  1. Transfection :
    - Introduction ADN ou ARN en utilisant des précipités de sels ou par
    liposomes (vésicules)
  2. Infection :
    - Introduction ADN ou ARN via des virus modifiés génétiquement
    - Avantage : efficace ++ et on peut utiliser le tropisme aussi (cibler un certain type
    cellulaire)
  3. Électroporation :
    - Cellules soumises à un courant électrique.
  4. Micro-injection :
    - Injecter Cas9 directement dans la cellule et peut même se faire directement
    dans le noyau
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Q

Vrai ou faux transfection :

	1. La transfection se fait bien chez tous les types cellulaires eucaryotes
	2. On parle d'expression transitoire lorsqu'on effectue de la transfection !
	3. L'insertion par transfection est dépendante d'une cassure dans l'ADN.

	4. La transfection est très utile dans le cas de surexpression et pour étudier l'effet 
    d'un surexpression d'un gène.
A
  1. La transfection se fait bien chez tous les types cellulaires eucaryotes
    - Faux ! Certains types cellulaires sont difficiles à transfecter (lymphocytes, cellules primaires, etc.)
  2. On parle d’expression transitoire lorsqu’on effectue de la transfection !
    - Vrai ! La plupart des plasmides ne seront pas répliqués de façon épisomale dans les c eucaryotes donc l’expression globale va décliner après la transfection = expression transitoire.
  3. L’insertion par transfection est dépendante d’une cassure dans l’ADN.
    - Vrai ! Dépendant d’une cassure proche du site d’insertion.
  4. La transfection est très utile dans le cas de surexpression et pour étudier l’effet d’un surexpression d’un gène.
    - Vrai ! L’insertion aléatoire dans le génome est suffisant pour étudier une surexpression !
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4
Q

De quoi parle-t-on quand on parle de faire de la transfection stable ?

A
  • C’est pour contrer l’expression transitoire.
    • On veut faire une lignée de cellule dans laquelle le gène muté sera exprimé de façon stable
    • On va donc sélectionner les cellules qui ont intégré le gène dans leur génome (~1/10 000). On doit donc inclure un marqueur de sélection dans le vecteur (ex: ATBr)
    • L’intégration du vecteur dans le génome est donc aléatoire !!
    • Des clones peuvent être sélectionnés en isolant les cellules dans des puits !
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5
Q

Quelles sont les 3 principales différences entre un transfection transitoire vs stable ?

A
  1. Durée analyse
    - Transitoire= analyse la transfection sur qq jours.
    - Stable = analyse de court à très long terme
  2. Durée mutation
    - Transitoire : perte de l’ADN en qq jours/sem
    - Stable: criblage par résistance ARBr
  3. Intégration ADN
    - Transitoire : expression transitoire car pas de réplication épisomale
    - Stable : L’ADN reste dans les cellules et peut s’intégrer dans le génome
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6
Q

Parlez-moi plus en profondeur de l’infection pour intégrer de l’ADN dans des eucaryotes.

A
  • Utilisation des virus pour introduire un gène dans une cellule eucaryote
    • C’est la méthode la ++ efficace pour introduire des gènes dans des c eucaryotes
    • On peut utiliser : rétrovirus, lentivirus, adénovirus
    • Utilisation de virus incapable de se répliquer après l’infection de leur cellules cibles !
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7
Q

Le choix des virus lors de l’infection pour intégrer de l’ADN dans des eucaryotes est médié par quoi ?

A
  • Par le tropisme du virus (quelles sont ces cellules cibles)
    • Est-ce qu’on veut intégrer l’ADN dans le génome de la cellule cible ou non ?
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8
Q

Quel est le cycle de vie général des rétrovirus ?

A
  1. Virus à ARN infecte les c
    2. Copie de l’ADN produire
    3. L’ADN est introduire au génome
    4. Création de nouvelles copies par transcription de l’ADN
    5. Expression des gènes d’encapsidation
    6. Création de nouvelles particules virales
    7. Lyse cellulaire

** Virus à ARN se servent d’une transcriptase inverse et de la machinerie de l’hôte pour produire de nouveaux virions

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9
Q

Pourquoi les lentivirus sont-ils un outil pour explorer la fonction des gènes ?

A

Car on est en mesure d’insérer une construction génique dans les cellules eucaryotes et de rendre le tout sécuritaire pour le manipulateur. Très utile pour le knock-down ou la surrexpresion des gènes.

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10
Q

Quelles sont les étapes pour apporter une modification génique via un lentivirus ?

A
  1. Possible de transfecter (sels ou liposome) le virus avec des régions LTR dans une cellule d’empaquetage.
  2. La cellule va répliquer seulement la région d’ADN cible (entre les LTR) ainsi que les protéines de l’enveloppe virales = encapsidation.
  3. Les cellules d’empaquetage produisent des particules pseudovirales.
  4. Infection des cellules hôtes par les particules. C’est la reverse transcriptase qui créer des l’ADNdb à partir de l’ARN sb virale suite à l’infection.
  5. Intégration de l’ADNdb au génome.
  6. Transcription puis traduction possible.
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11
Q

Pourquoi utilise-ton des cellules d’empaquetages avec les lentivirus ?

A
  • Parce que les cellules d’empaquetage expriment certains gènes essentiels au virus, mais sur d’autres allèles.
    • Ça permet donc d’avoir une construction qui ne contient de la construction d’intérêt à surexprimer/knock-down, sans les gènes d’encapsidation !
    • Donc pas de risque de réplication virale dans les cellules hôtes cibles !
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12
Q

Quels sont les 3 principaux avantages de l’infection lentivirale et les 2 principaux désavantages :

A

Avantages:

	1. Plus efficace que la transfection
	2. Capacité d'infecter des cellules quiescentes (ex: neurones)
	3. Tropisme !! Donc on peut cibler un type cellulaire en particulier

Désavantages:

	1. On doit produire les particules virales donc un peu plus de travail que la 
    transfection.  
	2. Risque de s'infecter localement (si on le boit par exemple)
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13
Q

Quelles sont les deux catégories d’actions qu’on peut faire pour étudier la fx d’un gènes ?

A
  1. Surexpression

2. Suppression (knock-down ou knock-out)

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14
Q

Lorsqu’on veut surexprimer un gène on va cloner ce gène dans un vecteur d’expression, expliquez cette méthode:

A
  • On clone le gène dans un vecteur qui a un fort promoteur constitutif d’origine virale (ex: CMV ou SV40) ou d’origine eucaryote quand on veut un expression un peu moins forte (elF1 et actine)
  • Puis on transfecte le plasmide dans des cellules en culture pour y observer l’effet de la surexpression.
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15
Q

Nommez un vecteur bien connu pour la surexpression des gènes, expliquez sa composition :

A

Vecteur : pcDNA3.1

	1. SV40ori : Origine de réplication virale pour les c animales, promoteur pour la 
         Neomycin
	2. Neomycin : Gène ATBr pour eucaryotes
	3. Pcmv : Promoteur viral qui permet la surexpression d'un fragment placé en aval
	4. Site de clonage multiple (+/- signifie à l'endroit ou à l'envers)
	5. Amp et pUC ori : Origine de réplication et résistance ATB bactériens
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16
Q

Que permet le système Tet, expliquez ce système :

A
  • Expression inductible de gènes
    • La protéine fusion permet de réguler l’expression d’un gène placé en aval du promoteur grâce à de faibles doses ATB (tétracycline ou doxycycline).
    • Le tout repose sur une protéine transactivatrice artificielle hybride : tTA (TetR + VP16)
    • TetR: reconnait l’ATB et interagit avec l’opérateur
    • VP16: protéine transactivatrice transcriptionnelle
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17
Q

Expliquez le système Tet-Off et Tet-on :

A

Tet-Off (tTA):

- Si ATB présent (ex: tétracycline) = ø de transcription
- Explication : ATB interagit avec la partie TetR de tTA= empêche le binding à l'opérateur

Tet-On (avec rtTA):

- Si ATB présent (ex: tétracycline) = transcription
- Explication: ATB réagit avec la partie TetR de rtTA = transcription !
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18
Q

Vrai ou faux préparation de lignées stables Tet-on ou Tet-off :

  1. La préparation de lignées stables nécessite 2 étapes de transfection : la première étape va être une lignée stable Tet-on ou off, puis la 2e est souvent une transfection transitoire.
  2. Un des avantage notable du système Tet, c’est qu’il a un effet gradable (effet graduel selon la dose d’ATB).
A
  1. La préparation de lignées stables nécessite 2 étapes de transfection : la première étape va être une lignée stable Tet-on ou off, puis la 2e est souvent une transfection transitoire.
    - Vrai !
  2. Un des avantage notable du système Tet, c’est qu’il a un effet gradable (effet graduel selon la dose d’ATB).
    - Vrai ! Plus on augmente la dose et plus la surexpression est présente.
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19
Q

Quelle sont les deux manières de faire de la suppression de gènes ?

A
  • Knock-down (par ARNi)

- Knock-out (destruction épigénétique)

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20
Q

Qu’est-ce que le système des ARNsi (petits ARN interférants)

A
  • Petits ARN de 21-23 Nt
  • C’est un mécanisme de défense naturel contre les virus à ARNdb chez les plantes et les mammifères.
  • C’est un système qui exploite que l’ARNdb est reconnu comme aberrant !
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21
Q

Expliquez le système des ARNsi :

A
  1. ARNdb est reconnu comme aberrant par Dicer
  2. L’endonucléase Dicer clive l’ARNdb en petits bout de 21-23 Nt.
  3. La protéine Argonaut va s’associer avec ces petits bout d’ARNdb de 21-23 Nt et va détruire 1 des deux brins et garder l’autre comme guide pour cibler les ARNm complémentaires dans la cellule.
  4. Complexe RISC formé. Lorsque l’ARNsi sera complémentaire à un ARN, il y aura coupure de l’ARNm par une sous-unité de RISC.
  5. La réplication de cet ARNm (viraux) est ainsi bloqué et la transposition également
22
Q

Quelles sont les deux approches utilisées pour cibler volontairement la destruction d’un ARNm ?

A

Créer des ARN db contenant la séquence de l’ARNm qu’on veut détruire

  1. Synthèse et transfection d’ARNdb
  2. Construction d’un ADN permettant l’expression d’un ARN court en tige-boucle (via transfection ou infection) = Short Hairpin RNA (shRNA)
23
Q

Quels sont les critères à respecter lorsqu’on fait la synthèse d’un ARNdb ?

A
  • ARNsi doit être dans l’ORF
    • Préférentiellement au milieu de la séquence codante (100 Nt après le codon start AUG et 100 Nt avant le stop)
    • Des logiciels sont dispos !
24
Q

Qu’est-ce que les shRNA ?

A
  • Short Hairpin RNA
  • Des ARN qui vont adopter une structure en tige-boucle (tige = au moins 20 Nt)
  • Ils vont être impliqués dans le phénomène d’interférence par ARN (clivé par l’endonucléase Dicer)
25
Q

Expliquez l’expression des shRNA et l’impact

A
  • On injecte un gène dans la cellule cible qui va l’expression d’un ARN qui aura une structure en tige-boucle
  • La portion tige-boucle aura au moins 20 Nt de long.
  • La cellule va reconnaitre cette tige-boucle comme un ARNdb, donc comme un ARN aberrant. Dicer va cliver puis garder un seul brin. Utilisé par le complexe RISC pour cibler els ARNm correspondant.
26
Q

Quels sont les 3 principaux avantages d’utiliser des shRNA ?

A
  1. Utilisation d’ADN (moins coûteux)
    2. Possibilité d’avoir des shRNA inductibles !
    3. Possibilité de répliquer la réquence d’ADN nous même, pas besoin de faire
    appel à des compagnies externes !
27
Q

Design d’un shRNA, expliquez la formation de la séquence ADN:

A

Composante séquence ADN:

	1. Promoteur
	2. Séquence sens ~21 Nt
	3. Besoin d'un séquence boucle ~6 Nt
	4. Séquence anti-sens ~ 21 Nt
	5. Terminateur

- Cette séquence n'existe pas en nature donc il faut en faire la synthèse in vitro. C'est très court, donc difficile de faire la PCR, mais on peut la synthétiser facilement
- Pour introduire la construction dans un vecteur, pas besoin de site de restriction aux extrémités. Les bouts cohésifs sont suffisants.
28
Q

Il est possible d’utiliser une banque d’ARNsi, pourquoi en utiliserions-nous une ?

A
  • Car ça permet d’identifier des gènes importants pour un processus donné (expression génique, division cellulaire, etc.)
  • Ça permet donc de cribler beaucoup de gènes d’un seul coup (plaque 96 ou 384 puits (chq puits contient un ARNsi ) !
29
Q

Définissez ce que veut dire faire le knock-out d’un gène :

A

C’est une perte physique de la séquence d’un gène conduisant à l’absence de l’ARNm et donc de la protéine.

30
Q

Il est possible de faire de la manipulation génétique des eucaryotes complexes pour faire de la suppression des gènes par Knock-out (KO). Expliquez les grandes lignes de la création d’une souris KO:

A
  1. Conception d’une cassette ADN
  2. Transfection de la cassette d’ADN dans les cellules embryonnaires souches (ES)
  3. Sélection et criblage des cellules ES mutantes
  4. Insertion des cellules mutantes dans un blastocyste normal en dev (implantation dans une mère porteuse et création de souris chimère).
  5. Croisement de ses souris pour obtenir des souris hétérozygotes (+/-)
  6. Croisement des (+/-) pour obtenir une descendances homozygotes (-/-)
31
Q

Vrai ou faux knock-out eucaryote:

  1. C’est une mutation qui est transmissible à la descendance.
  2. Quand on dit qu’un organisme eucaryote est KO d’un gène particulier, ça signifie que la séquence des deux allèles est affectée
  3. Faire un KO c’est l’équivalent de faire de la mutagénèse dirigée par remplacement allélique
A
  1. C’est une mutation qui est transmissible à la descendance.
    - Vrai !
  2. Quand on dit qu’un organisme eucaryote est KO d’un gène particulier, ça signifie que la séquence des deux allèles est affectée
    - Vrai ! KO homozygote -/- (deux allèles mutées)
  3. Faire un KO c’est l’équivalent de faire de la mutagénèse dirigée par remplacement allélique
    - Vrai ! Possible par recombinaison homologue
32
Q

On sait que la recombinaison homologue est moins fréquente chez les mammifères (ex: souris). Comment fait-on pour la favoriser ?

A
  • On la sélectionne par résistance ATB (insertion d’un gène ATBr dans la cassette)
  • Ainsi, on sélectionne les mutants dans lesquels la recombinaison homologue s’est produite .
  • On peut aussi augmenter les chances de recombinaisons homologues en utilisant des ribonucléases comme CRISPR/Cas9.
  • On fait aussi de la contre-sélection contre l’insertion off-target (au hasard)
33
Q

Pourquoi utiliserait-on se système CRISPR/Cas9 chez les cellules mammifères ?

A
  • Car ce système permet d’augmenter la fréquence de la recombinaison homologue !
    • Si on a peur à l’insertion de la cassette dans le génome, on peut introduire seulement la protéine et non la séquence !
34
Q

Quelles sont les 3 régions essentielles lors de la création d’un cassette pour un KO eucaryote ?

A
  1. Région d’homologie avec le gène cible (souvent un exon important)
  2. Marqueur de sélection positif (à l’intérieur de la région d’homologie)
  3. Marqueur de sélection négatif (à l’extérieur de la région d’homologie). C’est souvent HSV-TK.
35
Q

Parlez-moi du marqueur de sélection négatif HSV-TK :

A
  • C’est un marqueur situé à l’extérieur de la région d’homologie
  • Le gène exprimé est la thymine kinase virale HSV . Cette kinase en présence de ganciclovir est toxique.
  • Si la cellule eucrayote a inclue la cassette dans un site off-target, le gène de la kinase sera exprimé. Donc, la cellule va mourir !
  • Évidemment si la cassette s’est introduite au bon endroit le gène en dehors de la région d’homologie ne sera pas conservé, donc le gène de la HSV-TK ne pourra jamais être exprimé = les cellules sont donc résistantes au ganciclovir !
36
Q

Quelles sont les 3 principales différences entre une cellule qui a fait une insertion non homologue (au hasard) et une autre une insertion par recombinaison homologue de la cassette?

A

Insertion au hasard / recombinaison homologue

  1. Insertion par les bouts / Insertion par région d’homologie dans la cassette
  2. Marqueur HSV/TK inséré / HSV-TK ø inséré
  3. Sensible au ganciclovir / Résistante au ganciclovir
37
Q

D’où proviennent les cellules embryonnaires souches? Définissez !

A
  • Morula -> Blastocyste -> masse de cellules interne du blastocyste en dev
  • La masse de cellule interne d’un blastocyste contient toutes les cellules qui vont donner tout l’organisme à l’état adulte. La masse de cellule externe donne du tissus extra-embryonnaire (placenta, cordon, etc.). Les cellules de la masse interne sont pluripotentes donc elles vont donner tous les types de cellulaire retrouvés à l’état adulte.
38
Q

Nommez-moi les 5 principales caractéristiques des cellules souches embryonnaires :

A
  1. Pluripotentes ( possèdent le potentiel de devenir presque n’importe quel type cellulaire)
  2. On peut contrôler leur différenciation in vitro
  3. Elles peuvent être immortelles si conservées en bonnes conditions (hormones appropriées)
  4. Elles sont facilement transfectables !
  5. Possible de les réimplanter dans un blastocyste de souris !
39
Q

Dites les étapes résumées d’une implantation des cellules ES dans un blastocyste pour donner une souris KO:

A
  1. Microinjection des cellules ES mutantes (de souris au pelage noir) dans un blastocyste de souris blanche
  2. Implantation dans une mère porteuse
  3. Les cellules ES se mélangent au blastocystes = dév d’une souris chimère (pelage tacheté)
  4. Croisement de la souris chimère avec une souris blanche type sauvage = bb hétérozygote (+/-) pour le gène ciblé (noire)
  5. Croisement entre deux hétérozygotes = 1 +/+ : 2 +/- : 1 -/- (donc 1/4 de souris KO ! )
40
Q

Quelle est la différence entre totipotente et pluripotente :

A
  • Totipotentes : Cellule souche qui peut donner tous les types cellulaires (incluant les cellules extra-embryonnaires)
  • Pluripotente : Une cellule qui peut donne plusieurs types cellulaire (dans ce cas-ci cellules ES peuvent donner tous les types de cellules de l’embryon, mais pas extra-embryonnaire)
41
Q

Comment créer une souris KO en 4 étapes longues (texte résumé)?

A
  1. Préparer une construction d’ADN permettant de faire le KO: régions d’homologie, marqueur de sélection + dans la région d’homologie et marqueur - (TK) à l’extérieur de la région d’homologie.
  2. La cassette d’ADN est transfectée dans des cellules souches embryonnaires de souris noire. Les cellules incapables de pousser en présence de neomycine et ganciclovir ont en principe effectué le KO d’une des deux allèles ciblés (hétérozygotes +/-)
  3. Les cellules ES résistentes sont injectées dans un blastocyte en dev d’une souris blanche. La souris devient une mosaique pour les cellules +/- ( pelage tacheté). On espre que les cellules germinales de ces souris sont aussi +/-.
  4. Croisement des souris hétérozygotes avec des souris sauvages = 50% hétérozygote +/- et 50% sauvage +/+. Croisement des hétérozygotes = 25% homozygote KO -/-
42
Q

Comment est-il possible de contrôler une mutation dans le temps ou dans l’espace et pourquoi voudrait-on le faire ?

A
  • Faire un mutant KO inductible (ER-CRE-lox) ou même tissus spécifique (CRE-lox)
  • On peut l’utiliser dans les cas de mutation létales embryonnaires (aucune naissance) ou lorsque l,expression du gène muté est très large et donc el phénotype est très complexe
43
Q

Quelles sont les composantes du système Cre-Lox ?

A
  1. Cre : recombinase qui catalyse la recombinaison des sites LoxP
  2. Sites LoxP : séquence de 34 pb reconnu par Cre (13 nt palindromiques aux extrémités). Ces sites peuvent être recombinés par la Cre.
44
Q

Pourquoi le système Cre-lox fonctionne si bien dans les organismes eucaryotes spécialement ?

A
  • Parce que les sites loxP ont aux extrémités 13 Nt palindromiques, qui est impossible de retrouver dans le génome eucaryote !!!
  • Donc même si les deux sites sont très éloignés l’un de l’autre, ils vont quand même être recombinés par la Cre.
45
Q

Expliquer le fonctionnement du système Cre-Lox pour créer un KO:

A
  • Placer les sites LoxP dans la même orientation, de part et d’autre de l’exon dans la casette
  • Insérer la casette pour effectuer la recombinaison homologue
  • Les cellules vont exprimer normalement le gène, jusqu’à ce que Cre soit induite
  • En présence de la recombinase Cre, les deux sites seront clivés et il y aura recombinaison homologue entre les deux sites LoxP
  • Ça va causer l’excision de la séquence entre les deux sites, laissant un seul site LoxP dans le chromosome.
  • L’excision de la séquence permet donc de créer un knock-out (KO)
46
Q

Que permet l’insertion de deux sites LoxP en orientation opposées ?

A

Ça permet de faire un inversion de séquence !

47
Q

On peut contrôler l’expression de la recombinase Cre de deux façons, lesquelles ?

A
  1. Tissu spécifique : promoteur du gène Cre seulement actif dans un tissu en particulier
  2. Inductible : Cre fusionné à un domaine ER. L’ajout d’un agoniste relocalise la fusion ER-Cre = activation Cre = excision
48
Q

Expliquez en détails la Cre recombinase tissu-spécifique :

A
  • Gène floxé introduit dans un souris (sites LoxP )
  • La souris floxée est croisée avec une souris qui exprime la Cre seulement dans les cellules cardiaques
  • La descendance va donc donner une souris qui possède le gène absent seulement dans le cœur !
  • Ça permet donc d’étudier le rôle d’un gène essentiel dans des fonctions plus précises.

**P.S. Les souris Cre sont dispo commercialement. On doit seulement faire la souris floxée.

49
Q

Expliquez en détails un système de Cre recombinase inductible !

A
  • On a donc une Cre modifiée qui a un domaine régulateur d’un récepteur à l’oestrogène.
  • En présence d’un agoniste (qu’on injecte à un temps précis par exemple), la Cre devient active.
  • Ainsi, la présence de l,agoniste permet d,effectuer le knock-out
  • Quand l’oestrogène est dans la cellule, elle va interagir avec Cre4 son récepteur et va donc changer de conformation et va migrer au noyau pour s’associer avec les gènes et effectuer son activité recombinase avec les sites LoxP.
50
Q

Vrai ou faux.

Il est possible de combiner l’expression tissus-spécifique de la Cre à un système inductible.

A
  • Vrai

TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire (6 decks)

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