Luc Oligny - Cours 1

Question 1

Quels sont les deux types généraux de modalités diagnostiques moléculaires?

Answer 1

Celles qui évaluent l’ADN et celles qui évaluent l’ARN

Question 2

Que vont évaluer les tests basés sur l’ADN?

Answer 2

La présence d’un gène ou non et la présence de mutation(s)

Question 3

Quels sont les tests utilisant l’ADN?

Answer 3

Southern, PCR, FISH, CGH, SNP

Question 4

Quels sont les tests utilisant l’ARN?

Answer 4

Northern, RT-PCR, puces ARN, Western

Question 5

Quelle est la distinction entre l’ADN génomique et le cDNA?

Answer 5

ADN génomique provient de purification

cDNA provient d’ARNm réverse transcrit

Question 6

Quel est le principe du Southern blot?

Answer 6

ADN purifié en relativement grande quantité
Digestion avec une ou plusieurs enzymes de restriction
Migration par électrophorèse sur gel d’agarose
Transfert sur membrane
Détection par sonde (hybridation)

Question 7

Stringence vs. permissivité

Answer 7

Stringence si les paramètres empêchent l’hybridation à moins d’un appariement parfait
Permissivité si la sonde peut s’apparier avec des mismatchs

Question 8

Expliquer comment évaluer de façon semi-quantitative un gène, par exemple dans une tumeur.

Answer 8

On hybride la membrane avec 2 sondes, dont une qui reconnait un gène à copie unique.
On compare ensuite l’intensité du signal du gène d’intérêt avec ce témoin.

Question 9

Quels sont les inconvénients du Southern?

Answer 9

Nécessite de nombreuses manipulations: long et coûteux
Plusieurs étapes sont très longues et séquentielles, un diagnostic rapide est donc impossible
Besoin de beaucoup d’ADN

Question 10

Qu’est-ce qui explique les différences de taille entre les sites de restriction? (RFLP)

Answer 10

Séquences répétées (ALU, LINE, SINE, microsatellites, etc)

Question 11

Quelles sont les caractéristiques du dot blot?

Answer 11

pas de digestion nécessaire
pas d'électrophorèse nécessaire
peut évaluer des centaines d'échantillons d'un coup
hybridation sur membrane
évalue présence/absence

Question 12

Quel est le principe du Northern blot?

Answer 12

Extraction d'ARN cellulaire
pas de digestion!
migration par électrophorèse
transfert sur membrane
détection avec sondes marquées

Question 13

Quelle est la principale utilité du Northern blot?

Answer 13

Étude des gènes transcrits (exprimés) dans un tissu spécifique, par exemple une tumeur

Question 14

Quel est le principe du Western blot?

Answer 14

migration de protéines sur gel
transfert sur membrane
détection par anticorps

Question 15

Quel est l’avantage de l’immunohistochimie par rapport au Western?

Answer 15

Détection du type cellulaire et de la localisation de la protéine

Question 16

étapes d’un cycle de PCR

Answer 16

95C -> dénaturation
60C -> hybridation des amorces
72C -> synthèse par polymérase

Question 17

À quoi sert le RT-PCR?

Answer 17

déterminer si un gène est transcrit en ARNm

Question 18

Quels sont les avantages du PCR par rapport au Southern?

Answer 18

diagnostic en quelques heures
nécessite de très petites quantités d’ADN
peut être multiplexé
peu dispendieux

Question 19

Quelles sont les limites du PCR?

Answer 19

séquence des amorces doit être connue

amplification limitée à environ 1000bp

Question 20

Que permet le Q-PCR?

Answer 20

Évaluer le nombre de copies d’un gène dans un échantillon

Question 21

Quel est le principe de FISH?

Answer 21

hybridation fluorescente in situ

à partir de noyaux étalés sur lame

Question 22

Expliquer les sondes de séparation

Answer 22

deux sondes de couleurs différentes (normalement adjacentes)
fusion des signaux s’il n’y a aucun réarrangement
utiles pour savoir si un gène est réarrangé sans considération pour le gène partenaire

Question 23

Expliquer les sondes de fusion

Answer 23

deux sondes de couleurs différentes
chacune marque un gène d’intérêt
la fusion des gènes par réarrangement fusionne les signaux
utiles pour démontrer une translocation impliquant deux gènes en particulier

Question 24

Quelles sont les trois catégories de translocations oncogéniques?

Answer 24

Perturbation d’un gène suppresseur de tumeur
Couplage d’un promoteur actif avec proto-oncogène
Formation d’une protéine chimérique

Question 25

Les segments remaniés du chromosome du sarcome de Ewing sont trop éloignés pour permettre la détection par PCR. Comment détecter la translocation?

Answer 25

RT-PCR avec l’ARNm chimérique

Question 26

Comment peut-on déterminer l’expression d’un ou plusieurs gènes?

Answer 26

RT-PCR quantitatif sur micropuce CGH

Question 27

Comment diagnostiquer le bon virus chez un patient avec 2 souches très semblables dans un hopital?

Answer 27

PCR

Question 28

Comment résoudre problème de paternité?

Answer 28

RFLP

Question 29

Comment déceler présence bactérienne dans un expectorat?

Answer 29

PCR