Fragen Enzyme

Question 1

1. In vielen Enzym-Tests werden nicht die natürlichen Substrate und Produkte
   eingesetzt. Warum ?

Answer 1

1. Viele Produkte sind schwer nachzuweisen. Einige lassen sich nur schlecht messen,
   wohingegen andere schwer von den restlichen Substanzen der Reaktion zu
   unterscheiden sind. Daher werden gerne Substrate verwendet, die noch vom Enzym
   umgesetzt werden, jedoch leicht messbare Produkte liefern. Beispielsweise finden häufig
   Substrate Verwendung, die farbige Produkte liefern, die dann photometrisch detektiert
   werden können.

Question 2

2. Geben Sie ein Beispiel für eine durch eine Hydrolase katalysierte Reaktion !

Answer 2

2. Hydrolasen katalysieren eine Reaktion, bei der ein Wassermolekül an einer
   Verbindungsstelle addiert wird, die ursprünglich durch das Entfernen eines
   Wassermoleküls entstanden ist. Beispiele hierfür sind Ester, Peptidbindungen,
   glykosidische Bindungen….

Question 3

3. Wie werden Substrate im aktiven Zentrum gebunden ?

Answer 3

3. Das aktive Zentrum ist ein kleiner Teil des Enzyms, bei dem meist ein dreidimensionaler
   Hohlraum durch Aminosäuren unterschiedlicher Regionen und Polypeptidketten gebildet
   wurde. Das Substrat wird hier durch zahlreiche nicht-kovalente Wechselwirkungen wie
   z.B. elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals
   Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen gebunden. Die Spezifität des Enzyms für ein
   Substrat hängt dabei von der präzisen Anordnung der funktionellen Gruppen innerhalb
   der Bindungsstelle ab.

Question 4

4. Du denkst, ein Substrat passt in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins
   Schlüsselloch… Dein Kumpel ist da anderer Meinung, wer hat Recht ?

Answer 4

4. Beide haben bedingt Recht. Generell passt ein Substrat präzise in die Bindungsstelle wie
   ein Schlüssel ins Schlüsselloch. Allerdings ist die Bindungsstelle eines Enzyms nicht
   zwangsweise ein starres Konstrukt, sondern kann durchaus flexibel sein. So kann ein
   Substrat auch die Form der Bindungsstelle ein bisschen anpassen, eine Hypothese die als
   „Induced Fit“ bekannt ist.

Question 5

5. Bei einer enzymatischen Reaktion im Reaktionsgefäß kann es zur Einstellung eines

Answer 5

5. In der Zelle werden die Reaktionsprodukte in Folgereaktionen umgesetzt, daher erreicht
   die Reaktion hier kein Gleichgewicht.

Question 6

6. Beschreibe die Michaelis-Menten Gleichung ! Definiere alle Parameter !

Answer 6

6. V0 = Vmax(S/(S + KM))
Anfangsgeschwindigkeit:
V0
Maximalgeschwindigkeit:
Vmax
Substratkonzentration:
S
Michaelis Konstante:
KM

Question 7

7. Was bedeutet Vmax ?

Answer 7

7. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit oder Rate der Reaktion bei einer gewissen
   Enzymmenge, gesättigt mit Substrat.

Question 8

8. Was ist die Obergrenze von kcat / KM ?

Answer 8

8. Die Diffusionskontrollierte Interaktion von Substrat und Enzym bestimmt die
   Obergrenze der Rate. Diese liegt bei 108 – 109
   s
   -1M-1
   .

Question 9

9. Wie unterscheiden sich die Zwischenstufen bei Enzymmechanismen mit mehreren
   Substraten ?

Answer 9

9. Bei einem sequentiellen Mechanismus binden beide Substrate und bilden einen
   ternären Komplex aus. Bei einem Ping-Pong Mechanismus werden ein oder mehrere
   Produkte freigesetzt bevor alle Substrate gebunden sind. Somit werden hier
   ausgetauschte Enzymintermediate gebildet.

Question 10

10. Nennen Sie ein Beispiel, beidem beide Substrate vor der Katalyse gebunden werden.

Answer 10

10. Z.B. Laktatdehydrogenase und Kreatinkinase

Question 11

11. Denken Sie dass die Reihenfolge der Substratbindung eine wichtige Rolle für die
    Enzymkatalyse spielt?

Answer 11

11. In manchen Fällen, ja. Bei Ping-Pong Mechansimen beispielsweise muss das richtige
    Substrat binden um das korrekte Enzymintermediat zu bilden. Bei sequentiellen
    Mechanismen kommen sowohl geordnete Substratbindung (z.B. Laktatdehydrogenase),
    als auch ungeordnete Substratbindung und Produktfreisetzung vor (Kreatin Kinase).

Question 12

12. Wie unterscheiden sich die Typen der Inhibition kinetisch ?

Answer 12

12. Kompetitive Inhibition kann durch große Mengen an Substrat unwirksam gemacht
    werden. Jedoch ist der apparente KM – Wert erhöht. Bei der nichtkompetitiven
    Inhibierung kann Substrat an den EI Komplex binden, jedoch ist Vmax vermindert. Bei der
    gemischten Inhibierung können beide Werte abweichen.

Question 13

13. Was ist ein Affinitätslabel ?

Answer 13

13. Hierunter versteht man ein Substratanalogon, das strukturell dem Substrat sehr ähnlich
    ist, an das aktive Zentrum des Enzyms bindet und chemisch mit einem Rest des aktiven
    Zentrums reagiert. Es wird dazu verwendet, die Enzymstruktur und den
    Reaktionsmechanismus zu erforschen.

Question 14

14. Was sind Übergangszustandsanaloga ?

Answer 14

14. Diese sehr wirksamen Inhibitoren ahmen die Struktur eines Übergangszustandes im
    katalytischen Prozess nach. Sie binden sehr fest an das aktive Zentrum und sind nützlich
    bei der Aufklärung der Enzymstruktur und des Reaktionsmechansimus.

Question 15

16. Was ist die Herausforderung für eine Protease bei der Hydrolyse einer Peptidbindung?

Answer 15

16. Die Carboxylfunktion der Peptidbindung ist nicht sehr reaktiv. Die Protease muss
    diese Funktion aktivieren um den nukleophilen Angriff von Wasser zu
    unterstützen.

Question 16

17. Wie können kovalente Modifikationen genutzt werden um den Mechanismus eines
    Enzyms zu untersuchen?

Answer 16

17. Wenn für eine bestimmte Aminosäure angenommen wird, dass diese am
    Mechanismus beteiligt ist, führt eine kovalente Modifikation des Restes zu einer
    Änderung der Enzymaktivität. Jedoch, muss diese Methode gewöhnlich durch
    andere Techniken bestätigt werden (Bsp. ortsgerichtete Mutagenese,
    Zirkluardichroismus, …) um auszuschließen, dass der Verlust der Aktivität
    beispielsweise durch konformationelle Änderungen verursacht wird.

Question 17

18. Warum werden Substratanaloge eingesetzt um die Aktivität von Enzymen zu messen?

Answer 17

18. Ein Enzymaktivitätstest muss so gestaltet sein, dass der Verbrauch des Substrates
    bzw. die Bildung des Produktes schnell und einfach gemessen werden kann.
    Substrate die bei der Umsetzung ihre spektralen Eigenschaften ändern, können
    somit leicht mit Hilfe eines Spektrophotometers quantifiziert werden.

Question 18

19. Worin liegt die Ursache für den „burst“ der Aktivität und die folgende steady-state
    Reaktion von Chymotrypsin wenn man den Reaktionsverlauf mit Hilfe eines stoppedflow
    Spektrophotometer verfolgt?

Answer 18

19. Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen in einer Zweischrittreaktion. Dabei ist der
erste Schritt (Bildung des Acyl-Enzym-Intermediates) schneller ist als der zweite
Schritt (Hydrolyse).

Question 19

20. Was unterstützt die Theorie, dass die katalytische Triade ein effektives Mittel ist um
    die Hydrolyse von Peptide zu bewerkstelligen?

Answer 19

20. Zahlreiche verschiedene Enzyme unter ihnen die Peptidasen und einige Esterase
    nutzen ähnliche Reaktionsmechanismen. Während die Strategie dieselbe ist, sind
    die darin beteiligten Aminosäurereste verschieden. Dies führt zu den Schluss,
    dass dieser häufig zum Einsatz kommende Mechanismus das Ergebnis von
    konvergente Evolution ist.

Question 20

21. Was ist die allgemeine Strategie von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?

Answer 20

.
Alle nutzen einen Mechanismus bei dem ein Nukleophil gebildet wird, welches
dann die Carbonylfunktion der Peptidbindung angreift.

Question 21

22. Was ist das Nukleophil von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?

Answer 21

Das Nukleophil ist Wasser.

Question 22

23. Medikamentenentwicklung zur Inhibierung von Enzymen ist ein wichtiger Bereich der
    pharmazeutischen Forschung. Welche Enzymeigenschaften sind in diesem
    Zusammenhang interessant?

Answer 22

23. Enzyme können durch Wechselwirkungen mit einem potentiellen Wirkstoff,
    welcher entweder im aktiven Zentrum oder in einer regulatorischen Stelle
    bindet, inhibiert werden. Die Struktur von natürlichen Substraten und
    Aktivatoren und deren Bindungsstellen sind nützliche Angriffstelle für die
    Entwicklung neuer Medikamente. Dabei ist die Bindungsaffinität und Spezifität
    wichtig. Mit Enzymaktivitätstest kann der Einfluss der Inhibitoren auf kcat-, KM-,
    und Vmax-Werte bestimmt werden.

Question 23

24. Wie wird in der Gegenwart von Carboanhydrase Bicarbonat gebildet?

Answer 23

24. Ein Zinkion unterstützt die Bildung eines Hydroxidions, welches Kohlendioxid
    angreifen kann.

Question 24

25. Welches Merkmal von Carboanhydrase erlaubt die schnelle Hydratatisierung von
    Kohlendioxid?

Answer 24

25. Die räumliche Annäherung der beiden Reaktanten (Kohlendioxid und Wasser)
    und die Gegenwart eines Buffersystems welches die Protonentransferreaktionen
    unterstützt.

Question 25

26. Welchen Mechanismus nutzen Restriktionsendonukleasen um DNA zu spalten?

Answer 25

26. Ein aktiviertes Wassermolekül greift direkt das Phosphoratom der
    Phospodiesterbindung an.

Question 26

27. Die Sequenz der 6 basenpaarlangen Restriktionsschnittstelle von EcoRV ist GATXXX.
    Wie lautet die komplette Sequenz der Erkennungsstelle?

Answer 26

27. GATATC

CTATAG

Question 27

28. Warum sind P-loop Domänen und Mechanismen weit verbreitet?

Answer 27

28. Diese Strukturen sind in der Lage nach Bindung eines NTP große
    konformationelle Änderungen durchzuführen und NTP zu hydrolysieren. Diese
    strukturelle Vielfältigkeit erlaubt eine breite Spezifität.

Question 28

29. Warum sind Metallionen für die Aktivität der meisten NTP-abhängigen Enzyme
    notwendig?

Answer 28

29. Diese Enzyme binden nicht NTP, sondern den Metallionen-NTP-Komplex.

Question 29

30. Was ist die Funktion der Aspartattranscarbamoylase?

Answer 29

30. Das Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Synthese von Pyrimidinen. Es
    kondensiert Carbamoylphosphat und Aspartat zu N-Carbamoylaspartat und anorganischem
    Phosphat zu bilden.

Question 30

31. Geben Sie mehrere Beispiele für Enzyme und Proteine, die durch proteolytische
    Aktivierung aktiviert werden.

Answer 30

31. Beispiele sind Verdauungsenzyme (Trypsin), Hormone (Insulin), Gerinnungsenzyme
    (Fibrinogen), Entwicklungsprozess Proteinen (Kollagen) und Apoptose-Proteine (Caspasen).

Question 31

32. Warum war es überraschend, dass CTP ATCase hemmt?

Answer 31

32. Die Substrate für ATCase sind Carbamoylphosphat und Aspartat. Diese Moleküle ähneln
    nicht CTP. Somit war es klar, dass CTP nicht an der aktiven Stelle, aber dafür an einer
    anderen regulatorischen Stelle binden muss.

Question 32

33. Folgen allosterische Enzyme der traditionellen Michaelis-Menten-Kinetik? Zeichnen
    Sie ein Diagramm der Reaktionsrate relativ zur Substratkonzentration für ATCase und
    vergleichen Sie es mit dem Diagramm eines Michaelis-Menten Enzyms.

Answer 32

33. Nein, ATCase zeigt eine unterschiedliche Kinetik. Eine graphische Darstellung der
    Geschwindigkeit gegen Substratkonzentration zeigt eine sigmoidale Kurve, entgegengesetzt
    der einfachen hyperbolischen Kurve eines Enzyms das der Michaelis-Menten-Kinetik folgt.

Question 33

34. Wie unterscheidet sich das sequentielle Modell von dem symetrischen Modell für
    allosterische Enzyme?

Answer 33

34. Das symetrische Modell erlaubt nichts anderes als eine “Alles-oder-Nichts”- Form des
    Proteins (komplett gespannt oder entspannt). Im Gegensatz dazu ermöglicht das
    sequentielle Modell eine gemischte Art des Proteins, mit einigen gespannten und
    entspannten Untereinheiten. Die Form ist abhängig von der Ligandenbindung an eine
    bestimmte Untereinheit.

Question 34

35. Warum ist eine kovalente Modifikation im Vergleich zur proteolytische Aktivierung
    von Vorteil?

Answer 34

35. Kovalente Modifikation sind in der Regel ein reversibler Prozess.

Question 35

36. Phosphorylierung ist ein äußerst wirksames Instrument für die katalytische Steuerung.
    Erklären Sie die Gründe.

Answer 35

36. Eine Phosphorylgruppe fügt negativen Ladungen hinzu, so dass neue elektrostatische
    Wechselwirkungen und neue Wasserstoff-Bindung entstehen können. Die freiwerdende
    Energie bei der Phosphorylierung ist groß, wodurch sich das konformelle Gleichgewicht der
    verschiedenen Zustände beeinflusst werden kann. Die Verwendung von ATP bedeutet, dass
    die Reaktion mit dem Energie-Status der Zelle verknüpft ist. Phosphorylierung ist schnell,
    umkehrbar und kann zu verstärkenden Wirkungen führen. Diese Faktoren beeinflussen
    strukturelle, thermodynamische, regulatorischen und kinetischen Eigenschaften.

Question 36

37. Wie wird die Kinase-Kaskade aktiviert?

Answer 36

37. Der Prozess wird oft durch Hormone, die an Membran-Rezeptoren binden eingeleitet.
    Dieser Prozess aktiviert die Adenylat Cylase, die die Bildung von cAMP, einem intrazellulären
    Botenstoff bewirkt. Das cAMP aktiviert eine wichtige Protein-Kinase. In eukaryotischen
    Zellen ist dies ein allosterisches Enzym, die Protein-Kinase A, die dann verschiedenen
    Zielproteine phosphoryliert.

Question 37

38. Wie wird die Blutgerinnungskaskade initiiert?

Answer 37

38. Sowohl intrinsische (beschädigte Oberfläche) und extrinsische (Trauma) Auslöser können
    die Kaskade induzieren. Die ersten Schritte unterscheiden sich hierbei, führen aber letztlich
    zu einem abschließenden, gemeinsamen Weg, um die Fibringerinnsel zu bilden.

Question 38

39. Was ist der letzte Schritt im Blutgerinnungweg?

Answer 38

39. Im letzten Schritt wird Fibrinogen, welches sechs Ketten aus drei Typen Untereinheitenenthält,
    verändert. Thrombin spaltet vier der Ketten, was zur Bildung von Fibrinmonomeren
    führt. Diese Monomere bilden spontan das Fibrinnetz. Das Gerinnsel wird durch
    Querverbindungen zwischen den Aminosäuren katalysiert durch Transglutaminase
    stabilisiert.

Question 39

40. Was ist die zweifache Wirkung von Thrombin?

Answer 39

40. Zum einen katalysiert Thrombin die Hydrolyse von Fibrinogen um aktives Fibrin zu
    bilden. Zum anderen spielt es auch eine Rolle beim Herunterfahren der Kaskade durch
    Regulation von Protein C, einer Protease, die die Gerinnungsenzyme Va und VIIIa verdaut