8. ISH e FISH

Question 1

Cos’è la FISH?

Answer 1

è un esame di diagnostica molecolare che, tramite l’utilizzo di sonde, permette di valutare la presenza o meno di alterazioni al livello del DNA, sfruttando la capacità del DNA di legarsi a sequenze complementari. La sonda è legata ad un fluorocromo che emette fluorescenza

Question 2

Che tipo anomalie si possono riconoscere con la FISH?

Answer 2

-Anomalie numeriche (trisomie)
-Anomalie strutturali (traslocazioni)
-Amplificazioni geniche

Question 3

Quali sono le caratteristiche di una sonda?

Answer 3

-Può essere sia a DNA che ad RNA
-è formata da sequenze di DNA clonato (PCR + oligonucleotidi sintetici)
-La lunghezza ideale è tra le 50 e le 150 pb.

Question 4

Quali sono le sonde più usate?

Answer 4

-CEP: individuano le regioni centromeriche
-TEL: individuano le regioni telomeriche
-LSI: sonde date da sequenze specifiche omologhe
-WCP: per traslocazioni e riarrangiamenti

Question 5

Come si allestisce una FISH?

Answer 5

-Sezioni con microtomo
-Si lasciano in stufa per far sciogliere la paraffina
-si lava con xilolo per rimuovere tutti i residui di paraffina
-Si prepara il target eliminando lo strato lipidico/proteico soprastante
-Si denaturano target e sonda per farli legare
-Si lascia tutta la notte a 4º e il giorno dopo si lava tutto per togliere i residui
-Si colora con il colorante DAPI

Question 6

Come si possono vedere le traslocazioni?

Answer 6

-Sonde di fusione: uso due sonde di colore diverso che si sovrappongono tra di loro
-Sonde di separazione: due sonde che colorano un gene a metà e che si separano in caso di traslocazione