Cours 8- Stratégies de clonage et applications

Question 1

Parmi les clonages à bouts francs ou bouts cohésifs, lequel est le plus efficace?

Answer 1

Clonage à bouts cohésifs.

Question 2

Combien d’enzymes de restriction sont utilisés pour effectuer un clonage à bouts cohésifs non-directionnel?

Answer 2

1

Question 3

Quel est l’avantage fonctionnel du clonage directionnel?

Answer 3

L’obtention de l’insert dans le sens désiré permet l’expression appropriée de la séquence clonée qui est dans la bonne orientation par rapport au promoteur.

Question 4

Un clonage directionnel subit-il une digestion simple ou des digestions doubles?

Answer 4

Digestions doubles.

Question 5

Qu’est ce qu’une digestion double?

Answer 5

Digestion d’ADN par deux enzymes de restriction distinctes en une seule étape et dans les même conditions réactionnelles.

Question 6

Qu’arrive-t-il si les conditions réactionnelles ne sont pas adaptées pour les deux enzymes lors de digestions double?

Answer 6

1) Mauvaise efficacité de la digestion

2) Activité étoile

Question 7

Si l’activité de deux enzymes de restriction sont optimales dans des conditions de rx trop différentes , quelle méthode peut-on employer pour quand même cliver avec 2 enzymes de restriction?

Answer 7

On peut utiliser la méthode de digestions simples séquentielles.

Question 8

Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec 2 enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts francs?

Answer 8

Non, car ce qui permet un clonage directionnel est les extrémités cohésives. Sans bouts sb, on ne peut pas forcer de direction.

Question 9

Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec 1 enzyme de restriction qui génère des bouts francs et un qui génère des bouts cohésifs?

Answer 9

Oui. À ce moment là, on force la direction avec le site cohésif. Les deux bouts francs sont liés ensemble, et les deux bouts cohésifs aussi.

Question 10

Est-il possible de se retrouver en situation de clonage non-directionnel avec des bouts cohésifs provenant de 2 enzymes de restriction différentes?

Answer 10

Oui, si le site de reconnaissance pour les deux enzymes est le même.

Question 11

Est-ce qu’il y a une étape entre la digestion et la ligation? Si oui, quelle est-elle et comment s’effectue cette étape?

Answer 11

Oui, l’inactivation des enzymes de restriction à la chaleur ou la purification de l’ADN digéré.

Question 12

Quelle est l’activité enzymatique de l’enzyme ADN ligase T4?

Answer 12

Elle lie de manière covalente l’extrémité 5’-P et 3’OH des séquences d’ADN qui sont à proximité l’une de l’autre.

Question 13

Est-ce que l’enzyme ADN ligase T4 a besoin d’un apport énergétique?

Answer 13

Oui. Il le reçoit par l’hydrolyse de l’ATP en ADP et Pi.

Question 14

Comment peut-on inactiver l’enzyme ADN ligase T4?

Answer 14

Par la chaleur.

Question 15

À quelle température est ce que l’enzyme ADN ligase T4 aura une activité maximale?

Answer 15

16°C

Question 16

Quelle est l’étape la moins efficace du clonage moléculaire?

Answer 16

La ligation.

Question 17

Pour réussir un clonage moléculaire, quel est le ratio molaire idéal?

Answer 17

Ratio molaire insert: vecteur de 3:1

Question 18

Vrai ou faux. Un ratio molaire est exprimé en terme du poids moléculaire.

Answer 18

Faux. En terme du nombre de molécules.

Question 19

Qu’arrive-t-il si on diminue le ratio molaire insert :vecteur à 1:1?

Answer 19

Réduction de l’efficacité de la ligation insert:vecteur et favorisation de la recircularisation du vecteur sur lui-même. Ainsi, plus de vecteurs que d’inserts.

Question 20

Qu’arrive-t-il si on augmente le ratio molaire insert:vecteur à 9:1?

Answer 20

Augmentation du risque de ligation entre les inserts en format tête à queue, car ils sont complémentaires.

Question 21

Dans quelle situation doit-on habituellement inactiver ou éliminer la ligase avant l’étape de transformation?

Answer 21

Dans le cas où l’étape subséquente est une digestion pour linéariser les vecteurs parentaux.

Question 22

Nommez les 3 stratégies utilisées pour réduire la probabilité de sélectionner le vecteur parental suite à la transformation?

Answer 22

1) Purification du vecteur digéré sur gel
2) Déphosphorylation en 5’ du vecteur pour éviter que le vecteur parental se reconstitue par ligation
3) Digestion avec un enzyme de restriction dans l’insert parental.

Question 23

Qu’est ce que la transformation d’ADN?

Answer 23

C’est l’insertion d’ADN extracellulaire dans une cellule bactérienne.

Question 24

Qu’est ce que la compétence bactérienne?

Answer 24

C’est la capacité d’une bactérie à recevoir de l’ADN extracellulaire dans son cytoplasme.

Question 25

Nommez une bactérie qui est naturellement compétente.

Answer 25

Bacillus subtilis

Question 26

Pourquoi le CaCl2 et le rubidium rendent les cellules compétentes?

Answer 26

Car ils déstabilisent la membrane bactérienne. Ces sels contiennent des cations divalents (2+) qui vont neutraliser les charges négatives des acides téichoiques ou du LPS à la surface des bactéries et de l’ADN.

Question 27

Pourquoi est-ce que les cellules compétentes doivent être gardées au froid?

Answer 27

Pour préserver leur viabilité et leur compétence.

Question 28

Décrivez une transformation par choc thermique typique.

Answer 28

ADN incubé 30 min sur glace avec les cellules.
Incubation 2min à 42°C.
Retour sur glace 2 min.

Question 29

Quelle technique de transformation est la plus efficace? L’électroporation ou le choc thermique?

Answer 29

L’électroporation.

Question 30

La présence de sels dans l’ADN à electroporer n’affecte en rien le processus d’électroporation. Vrai ou faux.

Answer 30

Faux. L’ADN doit être dans l’Eau, et ne pas contenir de sels.

Question 31

Vrai ou faux. L’efficacité de la transformation est beaucoup plus grande avec de l’ADN non-surenroulé qu’avec de l’ADN surenroulé.

Answer 31

Faux. C’est le contraire.

Question 32

Certaines choses doivent être faite entre les deux digestions d’une digestion séquentielle pour assurer la bonne activité du deuxième enzyme. Qu’est ce qui doit être fait?

Answer 32

L’ADN cible doit être purifié entre chaque étape afin de rétablir les condition de tampon de réaction différentes entre les deux étapes de digestion. On repart donc à 0 pour recréer des conditions favorables au 2ème enzyme après la réaction du premier enzyme de restriction.

Question 33

Comment choisir les enzymes de restriction pour un clonage?

Answer 33

1) Conceptualiser d’abord le clonage désiré in silico, typiquement un clonage directionnel impliquant 2 ER différentes générant des bouts cohésifs
2) Sélectionner les enzymes appropriés selon la disponibilité des sites de restriction sur le vecteur de clonage
3) S’assurer que les enzymes sélectionnés ne clivent pas dans l’insert à cloner
4) Vérifier que les enzymes sélectionnés peuvent être utilisés en condition de digestion double
5) S’assurer que les bouts cohésifs pour les 2 enzymes de restriction ne sont pas compatibles.

Question 34

Que faire dans une situation où une seule des deux enzymes de restriction pouvant être utilisée pour un clonage a un site de restriction dans l’insert?

Answer 34

1) Effectuer une mutagenèse dirigée conservative pour éliminer le site de restriction dans le gène.
2) Procéder à un clonage non directionnel, puis sélectionner la construction souhaitée par diagnostic des clones obtenus. On utilise alors une seule enzyme, et ce n’est pas celle qui clive dans le gène.
3) On utilise une autre enzyme produisant des bouts cohésifs compatibles avec l’enzyme ne pouvant être utilisé pour digérer l’insert.

Question 35

Comment peut-on s’assurer de l’efficacité des digestions? Quel sera l’effet, et comment pouvons nous analyser les résultats obtenus?

Answer 35

1) On doit procéder par contrôle de digestions simples avec chaque enzyme sur le vecteur de clonage.
2) L’effet sera une linéarisation
3) On pourra analyser les résultats par une analyse de taille sur gel, parce que l’ADN migre a des vitesses différentes selon ses structures, même s’ils ont la même taille moléculaire absolue.

Question 36

Quelle est la ligase la plus utilisée en biomol? Pourquoi?

Answer 36

L’ADN ligase T4, pour des raisons de efficacité et de stabilité in vitro.

Question 37

Nommez une application de la ligation par l’ADN ligase T4 pour un clonage.

Answer 37

Liaison chimique entre un insert et un vecteur digérés

Question 38

Vrai ou faux. L’enzyme T4 ligase a une période d’incubation assez courte.

Answer 38

Faux. Elle est longue.

Question 39

Expliquez pourquoi la réaction de ligation est très efficace avec des bouts cohésifs simple brin?

Answer 39

Parce que les bouts cohésifs forment des ponts hydrogènes par complémentarité en maintenant la structure à lier en contact l’une avec l’autre.

Question 40

Expliquez pourquoi la réaction de ligation est peu efficace avec des bouts francs d’ADN?

Answer 40

Parce que les bouts francs ne reconnectent pas les séquences à lier. L’efficacité dépend alors de la probabilité de contact moléculaire selon le mouvement brownien et la concentration d’ADN.

Question 41

Comment peut-on s’assurer de l’efficacité d’une ligation? Comment analyser les résultats? Quel est l’effet de ce contrôle?

Answer 41

On effectue un essai de ligation avec un vecteur ayant été linéarisé suite à la digestion par 1 enzyme.

On peut observer la circularisation du vecteur, qui entraîne la formation de structures enroulées de l’ADN de poids moléculaires plus élevés observables sur gel d’agarose et qui permet au vecteur d’être maintenu dans des cellules bactériennes après transformation.

Question 42

Pourquoi est-il si important de réduire le nombre de molécules du vecteur parental avant la transformation?

Answer 42

Parce que le vecteur parental est surenroulé dû à son passage in vivo, et a conséquemment une affinité de transformation beaucoup plus grande que l’ADN non surenroulé comme la construction moléculaire effectuée par ligation in vitro.

Question 43

Dans le cas d’un clonage non-directionnel, le risque de recircularisation du vecteur parental est plus grand. Expliquez pourquoi, et comment on peut contrer cela.

Answer 43

Car les deux sites de restriction produisent des bouts cohésifs compatibles. Pour contrer la recircularisation, on peut déphosphoryler les groupements 5’P libres du vecteur après sa digestion, pour empêcher la réaction de ligation d’ADN 5’P et 3’OH libres du vecteur. On utilise une phosphatase qui clive les groupement libres en 5’ (Shrimp Alcaline Phosphatase)

Question 44

Qu’inclut le protocole d’induction de compétence?

Answer 44

Des lavages avec de CaCl2 ou du rubidium et des incubations sur glace.

Question 45

Quels problèmes pourraient diminuer les chances de succès d’un clonage moléculaire?

Answer 45

1) Mauvaise qualité de l’ADN utilisé
2) Faible efficacité de digestion ou activité étoile
3) Faible efficacité de la ligation
4) Faible efficacité de la transformation
5) Sélection du vecteur parental suite à la transformatioin

Question 46

Qu’est ce qu’un sous clonage?

Answer 46

C’est le transfert de l’insert d’un vecteur à un autre vecteur (couper-coller)