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TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire > 3. Analyse de Protéines et Interactions protéines/protéines et prot/ADN > Flashcards

3. Analyse de Protéines et Interactions protéines/protéines et prot/ADN Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que l’interactome ?

A

Ensemble des interactions moléculaires qui se produisent au sein d’une cellule (protéines/protéines, protéines/ADN, etc.)

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Q

Définissez ces types d’interaction protéines-protéines:

  1. Constitutives
  2. Stables
  3. Moyennes
  4. Transitoires
  5. Instantanés
A
  1. Constitutives : prot toujours retrouvées en complexe (ex: hétérodimères)
  2. Stables : Intercations fortes, mais pas nécessairement constitutives
  3. Moyennes : Complexes protéiques, etc.
  4. Transitoires : Hormone-récepteur
  5. Instantanés: Enzymes-substrats
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3
Q

Décrivez la purification d’un complexe protéique old school :

A
  1. Lyse cellulaire
  2. Extraction
  3. Précipitation différentielle
  4. Chromatographie
  5. Électrophorèse
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4
Q

Nommez les désavantages de la technique de purification d’un complexe protéique old school:

A
  1. Ardu
  2. Besoin de beaucoup de matériel de départ
  3. Chaque protéine a besoin de sa technique spécifique
  4. Pas une méthode facile et universelle
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5
Q

Les approches modernes sont basées principalement sur 4 principes, lesquels ?

A
  1. L’immunologie
  2. Étiquettes d’affinité
  3. Principes physiques complexes
  4. Approches génétiques
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6
Q

Nommez des approches modernes basées sur l’immunologie .

De quoi dépendent ces techniques ?

A
  1. Immunoprécipitation
  2. Western Blot
  3. ELISA
  4. Microscopie

Dépendent de la production d’anticorps spécifiques (polyclonaux et monoclonaux)

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7
Q

Production anticorps polyclonaux vs monoclonaux. Expliquez.

A

Poly :

  • Injection d’un antigène dans un lapin pour créer une immunisation
  • Récolte du sang, séparation du sérum
  • Récolte de tous les anticorps dans le sérum
  • Mettre sérum et antigènes en contact, isolation des anticorps qui reconnaissent l’antigène
  • Purification des anticorps spécifiques à l’antigène

Mono :
- Souri mis en contact avec l’antigène spécifique = immunisation
- Isolation de cellules souches de souris avec des cellules de myélome
- Création d’hybridomes (c avec 1 seul cytoplasme et 2 noyaux = les deux capacités, se répliquer comme une cellule tumorale et production anticorps)
- Isoler le mélange et sélection du meilleur anticorps ( moins de risque d’interaction non-spécifique)
PLUS COUTEÛX et PLUS LONG !!

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8
Q

Dites de quelle technique basée sur l’immunologie je parle :

  1. Utilisation d’un anticorps spécifique qui reconnait une protéine connue, couplé à une matrice solide, pour isoler la protéine d’une solution en contenant plusieurs !
  2. Immunoprécipitation d’un complexe protéique en ciblant une des composantes du complexe, afin d’identifier les autres membres.
A
  1. Immunoprécipitation (IP)

2. Co-immunoprécipitation (co-IP)

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9
Q

Nommez quelques méthodes d’immunoprécipitation :

  1. De précipitation
  2. De détection
A
  1. Précipitation:
    - Billes d’agarose, sépharose puis précipitation
    - Billes magnétiques , aimant
  2. Méthodes de détection:
    - SDS-Page (bleu de coomassie)
    - Western Blot
    - Spectrométrie de masse
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10
Q

Quelles sont les étapes générales d’une immunoprécipitation ?

A
  1. Récolte et lyse cellulaire
  2. Incubation de l’extrait avec des billes (billes couplées à l’anticorps spécifique)
  3. La précipitation des billes (agarose/sépharose poreuses ou magnétiques solides) permet de laver les protéines non-liées
  4. Les protéines sont éluées pour permettre l’analyse (éluées avec T° 98°C, avec un agent réducteur et détergent SDS-PAGE
  5. Analyse sur SDS-PAGE
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11
Q

Nommez 3 avantages et 5 inconvénients de l’immunoprécipitation :

A

Avantages :

  • Interactions détectées à partir d’extrait in vivo (cellules)
  • Purification spécifique et facile
  • Grande sensibilité

Désavantages:
- Besoin d’un anticorps
- Interaction directe ou indirecte (médié par un intermédiaire)
- Interactions > moyennes
- Exposition de l’épitope (dur de détecter les anitcorps monoclonaux
Attention au témoins !

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12
Q

Quel témoin utilise-t-on pour l’immunoprécipitation ?

A
  • Même expérience
  • Utilisation de billes sans anticorps
    = Permet de détecter si présence d’interactions non-spécifiques.
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13
Q

Qu’est-ce qu’une étiquette d’affinité (tag) ? Comment la créé-t-on ?

A

C’est une séquence peptidique ajouté à la protéine d’intérêt en C- ou N-terminal.

Création:

  • Création d’un gène fusion
  • In vitro : par clonage et approche de génie génétique
  • In vivo : par recombinaison homologue
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14
Q

Nommez quelques étiquettes fréquemment utilisées :

**Perso je ne vais pas apprendre ça… Mais je l’ai écrit au cas que toi tu voulais :D

A
  1. GST, a de l’affinité pour glutathione
  2. Flag-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
  3. HA-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
  4. Myc-tag, a de l’affinité pour un anticorps
  5. His-Tag (la seule que je connais :D), a de l’affinité pour le Ni (Nichel) car sa charge positive interragit avec le Nichel (précipitation protéine d’intérêt.
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15
Q

Qu’est-ce que l’essais Pull-down?

A

Co-précipitation in vivo ou in vitro
(Soit à partir d’extraits ou sur les protéines recombinantes pures)

  • Une protéine est fusionnée à une étiquette (GSTou His-tag) immobilisée sur une bille.
  • Incubation en présence de l’autre protéine (extrait mixte ou purifiée)
  • Plusieurs étapes de « lavage »: pour éliminer les interactions non-spécifiques
  • Il faut un contrôle sans étiquette !!!!
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16
Q

Avantages et inconvénients méthode Pull-down

A

Avantages:

  • Universel (ou presque)
  • Protocole simple
  • Possibilité de déterminer des interactions directes (in vitro avec composants purifiés)

Inconvénients:

  • Présence d’une étiquette (risque de dénaturation)
  • Requiert la préparation de gènes fusion
  • Interactions >moyennes
  • Attention au repliement in vitro des protéines recombinantes
  • Purifications « sales »
17
Q

Qu’est-ce que la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) ?

A
  • Interaction protéines-protéines
  • 2 étiquettes d’affinités avec un site de clivage entre les 2.
  • Implique la création d’une protéine fusion portant une étiquette TAP
  • Analyse des complexes par électrophorèse, immunobuvardage western ou spectrométrie de masse.
  • Essais enzymatique
18
Q

Qu,est-ce qu’une étiquette TAP ?

A

L’étiquette TAP contient 3 éléments qui permettent 2 purifications en série:

  1. ProtéineA (liaison à des billes portant des IgG à leur surface)
  2. Site de clivage de la protéase TEV = libération des protéines immobilisées sur billes
  3. Calmoduline binding peptide qui permet la liaison à des billes de calmoduline en présence de calcium. Le calcium permet d’éluer.
19
Q

Une élution douce avec la méthode TAP permet quoi ?

A

Beaucoup de flexibilité pour l’analyse qui va suivre après l’élution ! Donc une élution au calcium au lieu d’avec une T° élevée ou un chmt de pH va permettre d’éviter une dénaturation ! Le complexe sera isolé, purifié et propre prêt à l’analyse !

20
Q

Méthode TAP avantages vs désavantages:

A

Avantages:
• Universel (ou presque)
• Haut degré de purification
• Possibilité d’élution «douce» des complexes
• Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)

Désavantages:

  • Direct ou indirect?
  • Présence d’une étiquette(risque de dénaturation)
  • Interactions > moyennes
21
Q

Qu’est-ce que la méthode BioID ?

A
  • Approche basée sur le marquage méthabolique par la biotine
  • La protéine appât est fusionnée à BirA qui est une biotine ligase de E.coli (version modifiée de BirA qui peut biotinyler de manière non-spécifique)
  • La biotine va être ajoutée à toute prot in vivo proche de l’appât
  • Une fois biotinylées, les protéines seront purifiées avec des billes-streptavidines et identifiées par LC-MS/MS
22
Q

Avantages et inconvénients de la méthode BioID :

A

Avantages:

  • Universel (oupresque)
  • In vivo
  • Haute sensibilité
  • Détection d’interactions transitoires
  • Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)
  • Fonctionne bien pour les complexes insolubles
Inconvénients:
• Détection de proximité
– Biologiquement significatif? 
– Risque de faux-positifs
• Présence d’une enzyme sur la protéine appât = risque de dénaturation, de nuire à la structure de l’appât

TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire (6 decks)

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