Aislamiento de proteínas de un proteoma Flashcards
(34 cards)
Caracterización de un proteoma
Preparar las muestras puras de sus proteínas, utilizando tecnologías tradicionales y métodos cromatográficos
2 técnicas
- Electroforésis bidimensional en geles de poliacrilamida
- Espectrometría de masas
Para caracterizar un proteoma
se deben separar las proteínas y determinar su identidad
separación de proteínas se hace mediante:
electroforesis bidimensional en gel de poliacramida o 2D-PAGE
la separación según la carga es seguida por la…
separación según la masa
Detergente SDS del electroforésis en gel
desnaturaliza las proteínas y confiere una carga negativa
Las proteínas se separan de acuerdo a
sus masas moleculares
migrando las proteínas más pequeñas más rápido al electrodo positivo
la tinción de gel después de la electroforesis revela
un patrón complejo de manchas
cada una con una proteína diferente
limitaciones de la electroforésis en gel
- no todas las proteínas de un proteoma serán visibles
- problemas de reproducibilidad
- no es cuantitativa
procedimiento de identificación de las proteínas de un proteoma rápido y preciso gracias a:
la esepectrometría de masas y sus avances
hay 2 sistemas de ionización
- Mediante desorción por láser (MALDI)
- Por electrospray asistido por radioactividad (ESI)
¿Cómo se ven representadas las proteínas diferente en la electroforésis en gel bidimensional?
Un patrón complejo de manchas
en vez de identificar la secuencia de aminácidos, las proteínas
… o los fragmentos peptídicos se separan de acuerdo a su relación masa-carga
espectrotómetro de masas (3)
Un espectrofómetro de masas consta de 3 unidades:
- presenta un dispositivo de ionización ( 2 sistemas: MALDI y ESI)
- cámara de separación (TOF)
- detector
espectrotómetro de masas (3)
(1) ¿Qué hace un dispositivo de ionización?
Transforma fragmentos peptídicos individuales de la fase sólida en una fase gaseosa
espectrotómetro de masas (3)
(2) ¿Qué sucede en la cámara de separación?
Los iones se mueven a tráves de un vacío de acuerdo con su carga y masa y se separan sobre la base del tiempo de vuelo (TOF)
espectrotómetro de masas (3)
(3) Caracacterísticas del detector
- enorme sensibilidad
- poder de resolución para separar los picos de especies moleculares diferentes
V/F
Las proteínas se rompen en fragmentos antes de ser analizados mediante MALDI-TOF
Verdadero
enfoque estándar de MALDI-TOF
purificar la proteína de una mancha en un gel y luego dirigirla con una proteasa específica (como tripsina)
hasta 75 aminoácidos de largo
Tripsina función
Escinde las proteínas inmediatamente después de residuos de arginina o lisina
relación masa-carga permite
determinar la masa molecular
corresponde a cada pico observado por espectrometría
un péptido
Protocolo para identificar una proteína de interes en gel y espectrometría
- Selección de una mancha
- Digestión con proteasa
- Espectrometría de masas
- Comparación en base de datos
V/F
Las identidades proteícas se estiman automáticamente de los perfiles de péptidos obtenidos en la espectrometría
Verdadero
los perfiles se generan in silico
