PCR Flashcards
(35 cards)
Hay 2 tipos
Cualitativa (fundamentos) y cuantitativa (tiempo real)
Tecnologia inovadora del mundo
Sirve para conocer cantidad de acidos nucleicos
Resultados confiables en poco tiempo
Alta sensibilidad, reproductividad
PCR
Fundamentos
Reaccion enzimatica (ADN polimerasa)
Gracias a ella sintetiza naturalmente el ADN en las celulas
Cuales son los 2 tipos de ADN
ADN genomico: PCR
ADN complementario del RNAm: RT-PCR (transciptasa reversa)
Cuando se usa el ADN complementario
Para algun gen de interes
Elementos principales
Molde
* Enzima: desoxirribonucleotidos trifosfatos y magnesio
* Oligonucleotidos primers: buffer, H20
Etapas de la PCR
- Desnaturalizacion
- Hibridacion
- Extension
Aparato utilizado en la PCR
Termocicladores: establece sistema homogeneo en donde la temperatura y tiempo no se modifiquen en cada uno de sus ciclos
Que pasa al final de la reaccion
Se debe corroborar si se amplifico el blanco de interes (AMPLICONES) y son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reaccion fue exitosa
Cual es la enzima mas usada
Taq ADN polimerasa (viene de Thermus aquaticus), es termoestable
Que son los primers
Secuencias de oligonucleotidos que delimitan la secuencia blanco que desea amplificar y son complementarios a esta
Tamaño de primers
15-25 pares de bases y la cantidad G-C no debe de exceder 55% de la secuencia
Cuales son las 2 secuencias de primers
Sentido/forward y antisentido
Desnaturalizacion
ADN calentada y separadas a 95º por 20-30 seg
Tiempo depende de concentracion G-C (proporcional)
Hibridacion
Se alinean primers en 3’
Temperatura 50-60º
Diseño de primers y temperatura correcta = especificidad y estabilidad del complejo sera eficiente
Extension
Taq-polimerasa actua sobre complejo templado-primers, agrega dntps’ complementarios para hacer cadenas completas de ADN
Extension de cadenas es en direccion 5’ a 3’
Temperatura: 72º
AL final del ciclo: amplicones
Analisis
Se usa gel de agarosa
Electroforesis: separa moleculas a gtravez de matriz solida que funciona como filtro para separar moleculas en un campo electrico
La separacion se hace bajo un buffer/tampon
Grupo fosfato da carga - (migra a lado +)
PCR en tiempo real
- Cuantifica secuancias especificas de a.n usando reporteros fluorescentes en la reaccion
- Detecta los productos amplificados en cada ciclo de la reaccion
- Permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra
- Producto de amplificacion: no necesita uso de gel
Aplicaciones PCR tiempo real
Saber cantidad ARNm de celulas o tejido
Aun con pequeña cantidad se garantiza alta sensibilidad, especificidad y eficiencia
Ingredientes PCR
Mismo que PCR pero se le conoce como Master Mix, el agua va por separado y es libre de nucleasas
Pares de bases: 100-150
Uso de termocicladores ademas de lo de temperatura y tiempo
Excita sistema de fluoresencia
Captura señal de emision del mismo
Analisis cuantitativo
- Su diferencia es la fuente de energia y la velocidad
Como se analizan los resultados
Termociclador tiene software que genera graficas (muestra curso y progreso y otra la disociacion que muestra la especificidad de la reaccion)
La cuantificacion puede ser
Absoluta: numero exactoi de copias amplificadas (para medir carga viral o bacteriana en diferentes tejidos)
Relativa: evaluar cambios de expresion de genes en distintos estados fisiologicos (gen blanco vs gen de referencia)
Despues de la electroforesis que sigue
no se que de carga
