1. Wie beseitigt man Reste anorganischer Säuren?
mit Wasser verdünnen, mit NaOH neutralisieren, verdünnen, Ausguss
2. Wie beseitigt man Reste anorganischer Laugen?
mit verdünnter Säure (H2SO4) langsam neutralisieren und stark mit Wasser verdünnt in Ausguss leeren
3. Wie beseitigt man Reste organischer Lösungsmittel?
in die dafür vorgesehenen Behälter (Beschilderung der Container)
4. Sie verätzen sich mit Säuren oder Laugen. Was tun Sie?
Spülen mit viel Leitungswasser, auch bei Mundverletzungen
5. Sie müssen mit einer Ihnen in Hinsicht auf Gefährlichkeit unbekannten Verbindung arbeiten. Was müssen Sie vor Arbeitsbeginn tun?
Information über Giftigkeit und Handhabung beschaffen (zB Bücher)
6. Eine ätzende Substanz ist ins Auge gespritzt. Maßnahmen?
Spülen mit Leitungswasser, Kopf nach hinten beugen, vom inneren Augenwinkel her unter Spreizen der Lider spülen. (Spezialaugendusche) Danach zur Augenklinik.
7. Warum sind elektrostatische Aufladungen von Menschen und Geräten im Labor gefährlich? Welche Gegenmaßnahmen können Sie treffen?
Zündgefahr durch Entladung Gegenmaßnahmen: - nur leitfähige bzw. nur nicht leitfähige Geräte kombinieren - tief ins Gefäß reichende Trichter verwenden, um Zerstäuben der auslaufenden Flüssigkeit zu vermeiden
8. Es brennt! Was tun Sie?
Brand löschen: tragbarer Feuerlöscher (lüften), Löschsand, Löschdecken Feuerwehr anrufen, 122
1. Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialien dem Medium oft EDTA zu?
Beim Aufschluß treffen Substanzen aufeinander, die normalerweise durch unterschiedliche Kompartimente getrennt sind, weiters kommt das Zellmaterial in Berührungen mit Metallteilen (Apparaturen). Um ungewünschte Reaktionen zu verhindern wird zum Beispiel EDTA eingesetzt. Es komplexiert Schwermetallionen (Fe2+, Fe3+, Cu2+,..), die gern mit O2 Sauerstoffradikale bilden. Weiters bindet es Mg2+ (→ Kofaktor, hemmt so Enzymaktivität von zB DNase); und entfernt Ca2+ aus Membranen (→ gesteigerte Permeabilität).
2. Warum setzt man beim Aufschluss biolog. Materialien dem Medium oft red. Glutathion o. ä. zu?
Oder andere SH-hältige Substanzen (Dithiothreit) als Antioxidantien. Glutathion ist ein Tripeptid aus Glu-Cys(SH)-Gly in der Reduzierten Form. Es reduziert funktionelle Gruppen von Proteinen und schützt so vor Oxidation. Wichtig in Erythrocyten. Oxidierte Form: Glu-Cys(Gly)-S – S-(Gly)CysGlu.
3. Wie wirkt Ultraschall auf biologisches Material?
Erzeugt Druckschwankungen. Bei 10-40kHz in flüssigen Medien erzeugt es Löcher = Kavitation, dadurch werden Zellen und Organellen relativ brutal zerrissen. Nachteil: effiziente Kühlung erforderlich, DNA fragmentiert, nicht schonend.
4. Was bewirkt Lysozym, wo wendet man es an?
Baut Peptidoglykan in Gram+ Bakterien ab und verdaut so die Zellwand, wirkt als Endoenzym, Zellmembran kann dann mit Detergentien oder osmotischen Schock zerstört werden.
5. Wenn Sie aus tierischem Gewebe intakte Organellen isolieren wollen, welcher Methode werden Sie den Vorzug geben: Homogenisator nach Merckenschlager, nach Potter, oder Ultraschall?
Merckenschlager: brutal, heiß (Denaturierung!), nicht notwendig bei Zellen ohne Zellwand Ultraschall: siehe 3.: brutal, heiß, DNA fragmentiert. Potter: wirkt über Scherkräfte, relativ schonend
6. Worin könnte der Nachteil der Autolyse mit Essigester liegen?
Essigester, organisches Lösungsmittel. Nicht effizient bei hydrophoben Membranbestandteilen (Membranproteine erschweren den Aufschluß).
7. Wie müssen die meisten Mikroorganismen vorbehandelt werden, um anschließend leicht osmotisch lysiert werden zu können?
die Zellwand muss zerstört werden, bei Gram+ kann dies mit Lysozym gemacht werden
8. Welche Substanzen können Sie durch Dialyse entfernen?
Niedermolekulare Substanzen; LM, Salze, kleine Moleküle, die durch die semipermeable Membran passen.
9. Warum nimmt bei der Dialyse das Volumen im Schlauch zu?
Aufgrund des osmotischen Gleichgewichts
10. Mit dem Ihnen zur Verfügung stehenden Rotor können Sie nur die Hälfte der vorgeschriebenen Touren laufen. Was tun Sie, damit die Zentrifugation das erwünschte Resultat bringt?
Es gilt: (min1)*(rpm1)^2 = (min2)*(rpm2)^2 , daher muss man bei halber Geschwindigkeit die 4fache Zeit einrechnen.
11. Sie zentrifugieren bei 100.000x g zwei Röhrchen, die sich um 0,2 g unterscheiden. Mit welcher (Unwucht-) Kraft belasten Sie dabei den Antrieb?
100.000g * 0,2g = 20.000g = 20kg = 200N
12. Welche biologischen Makromoleküle können Sie durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln fällen?
Proteine: mit Aceton zum Beispiel → Verknappung der Solvathülle führt zu Protein-Protein-WW, Proteine fallen aus DNA: in 2-3fachem Volumen EtOH zum Beispiel → Alkohol zieht die Hydrathülle ab, DNA aggregiert.
13. Warum fallen Proteine bei Zusatz von Aceton aus?
Makromoleküle sind durch die Wechselwirkung mit Wasser stabilisiert, wenn die Lösungsmittelzusammensetzung deutlich verändert wird, werden sie infolge unspezifischer Assoziationen unlöslich. Aceton verringert die Dielektrizitätskonstante, dadurch werden die Anziehungskräfte zwischen Seitenketten verstärkt. Kälte setzt zusätzlich die Löslichkeit herab.
14. Warum fallen Proteine bei Zugabe von Ammonsulfat aus?
Die Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und Protein wird energetisch ungünstiger, die Hydrathülle wird abgezogen, Proteine falten sich kompakter und fallen aus. Vorteile: native Konformation stabilisiert, reversible Fällung
15. Die Fällung von Proteinen aus ihrer Lösung durch Zugabe von Ammonsulfat bzw. durch Erhitzen unterscheiden sich grundsätzlich. Wodurch?
Ammonsulfat -> reversible Fällung, geringer Verlust an biologischer Aktivität Erhitzen -> Denaturierung der Proteine, Verlust der biolog. Aktivität, nicht reversibel
16. Wie kann man die verdünnte Lösung eines Enzyms möglichst schonend konzentrieren?
(Ammonsulfat)Fällung, Ultrafiltration unter Druck, Umgekehrte Dialyse (Sack mit wasserbindenden Substanzen wie Zellstoff, PEG außen, die H2O entziehen), Austauschergele
17. Bei der Isolierung eines Proteins stellt sich Ihnen die Frage, ob Sie eine Fällung mit Ammonsulfat noch durchführen oder auf den kommenden Arbeitstag verschieben. Wie werden Sie sich entscheiden und wovon hängt diese Entscheidung ab?
Definitiv durchführen! Gefällte Proteine sind stabiler durch die kompakte Faltung, außerdem sind bei dieser Ionenstärke Proteasen annähernd inaktiv.
18. Warum geben Sie bei der ADH-Bestimmung Semicarbazid zu?
Semicarbazid bindet das Produkt Acetaldehyd und nimmt es so aus dem Reaktionsgleichgewicht → die Reaktion läuft bevorzugt in Richtung des Acetaldehyds, es findet keine Rückreaktion statt
19. Wovon hängt die Sedimentation in der Zentrifuge ab?
Dichte, Teilchengröße (Rotationsgeschwindigkeit, Achse)
1. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Warburg-Christian?
Beruht auf den eigenen charakteristischen Eigenschaften von Proteinen in Lösung. NS absorbieren bei 260nm, Aromatische As bei 280nm. Daher kann die Gesamtproteinmenge errechnet werden: Proteinconc = 1,56 x E280 – 0,757 x E260 Nukleinsäurenconc = -35,50 x E280 + 62,500 x E260 Störungen, Probleme: Trp absorbiert 10x stärker als Tyr; Niedermolekulare Substanzen, Trübungen, im UV absorbierende chromophore Gruppen,
2. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Lowry?
Beruht auf der chemischen Reaktion mit funktionellen Gruppen. 2 Reaktionen: Biuret-Reaktion (alkalisches Milieu!, Cu2+ als Chelat an Peptidbi) + Reduktion von Folin-Reagenz durch Tyr und Trp; Messen bei 750nm Störungen, Probleme: Reduktionsmittel, NH2-Gruppen, Detergentien, Ammonsulfat
3. Worauf beruht die Proteinbestimmung nach Bradford?
Beruht auf der Ionischen Bindung von Sulfonatgruppen von Coomassie B.B. an positiv geladene Gruppen des Proteins bei saurem! Milieu. Gemessen bei 595nm. Störungen, Probleme: Nicht alle Proteine sind Anionenbinder
