Analisis de acidos nucleicos Flashcards
(15 cards)
Pasos para extraer el DNA por tecnica fenol-cloroformo
1.Lisis de celulas con cloruro de amonio y SDS que rompen membranas
2. Precipitacion de proteinas y lípidos con fenol cloroformo
3. Precipitacion del DNA con etanol 100% y sol salina salturada
4. Lavado de DNA con etanol y agua para deshidratarlo
Cuando ya extrajiste el DNA que se hace?
Espectrofotometria, mide la concentracion del DNA. Mientras mas luz absorva hay mas concentracion.
DNA y RNA absoben 260nm
En cuanto tiene que salir la pureza del ADN?
si es arriba de 1.8 la muestra se puede usar
Que materiales necesitas en el PCR?
Secuencia de ADN, enzima ADN polimerasa (Taq), cloruro de magnesio (buffer), desoxirribonucleotidos y primers
Se meten al termociclador
Como debe de estar el pH en una PCR
8.4
Fases de la PCR
Iniciacion- Primers hechos en laboratorio, reconocen secuencia molde
Desnaturalizacion- separa las cadenas de DNA a 95º
Hibridacion- entran los primers al extremo 3’ y complementan la secuencia molde a 50º
Extension- Taq polimerasa agraga dNTP complementarios a 72º
Electroforesis
Cuantas veces se hace un ciclo de PCR?
De 3 a 7
Electroforesis
Separa biomoleculas por peso y carga en un campo magnetico
Gel de agarosa- es un polisacarido con poros. Su concentracion depende de el tamaño de la molecula que se analice
Formula de temperatura de hibridacion
((4* G + C) + (2* A + T))=
Tipos de PCR
Estándar- detección cualitativa
Múltiple- detección cualitativa de varios segmentos en una sola reacción
RFLP- detección de polimorfismos genéticos con enzimas de restricción
PCR-RT - expresión de genes y viruses
TR-RCP (real time)- cuantificación de genes
Para que nos sirve un PCR?
Cuantifica la cantidad de DNA en la muestra, es el método más sensible
Sistema reportero fluorescencia- específicos y no especificos
Específicos- Sondas fluorescentes de oligonucleótido
No específicos- Moléculas intercalantes que tienen afinidad por el dsDNA con SYBER Green
Secuenciación de sanger
Determina la secuencia exacta de nucleótidos en un fragmento de ADN
Preparación para la secuenciación de Sanger
Se amplifica el fragmento con PCR, con nucleótidos normales y nucleótidos terminadores marcados con fluorescencia
Con electroforesis y láser se detectan los marcadores de fluorescencia
Que son los ddNTPs carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3’
Lo que causa la terminación de la síntesis de ADN cuando se incorporan en la cadena
Son los de fluorescencia
