Analys av ak/ag för immundiagnostik Flashcards
(35 cards)
Vilken egenskap hos antigenen krävs för att antikropparna ska kunna bilda korsbindningar och skapa stora nätverk/immunkomplex?
Att antigenen har fler än ett bindningsställe
Vad innebär agglutination?
Antikroppsmedierad ihopklumpning av olösliga större partiklar tex bakterier, celler eller plastkulor täckta av antigener
Vad innebär precipitation?
Antikroppsmedierad utfällning av lösliga molekyler. Korsbindning av lösliga antigener + antikroppar bildar ett synligt precipitat
Hur går en direkt agglutionationsreaktion till? Ge exempel på när detta används
Antigenspartiklar + korresponderande antikroppar –> Synlig agglutination
Tex blodgruppsbestämning
Hur går en indirekt agglutionationsreaktion till? Ge exempel på när detta används
Lösligt antigen sätts på partiklar (tex kulor/beads), sedan tillsätts korresponderande antikroppar –> synlig agglutination
Tex TPPA (treponema pallidum particle agglutination assay)
Vad är principen för TPPA?
Antikroppar mot gelatinpartiklar täckta med syfilisantigen mäts i en spädningsserie
Beskriv radiell immunodiffusion (Mancini)
Antigenspecifik antikropp ingjuten i gel. Till brunnar i gelen tillsätts antigen och när antigenet diffunderar ut i gelen bildas en synlig utfällning.
Arean på utfällningscirkeln är proportionell mot antigenkoncentrationen i provet
Beskriv dubbel immunodiffusion (Ouchterlony)
En semikvantitativ äldre metod som fortfarande används. Kan användas för att detektera antikroppar mot en stor mängd olika antigener. Om patienten har antikroppar mot allergenet bildas en utfällningsreaktion som syns tydligt efter Coumassiefärgning
Vad färgar Coumassiefärgning? Vilken färg?
Proteiner färgas blå
Definiera turbidimetri
Minskning av ljusgenomsläpplighet per tidsenhet
Definiera nefelometri
Ökning av ljusspridning per tidsenhet
Vad är “solid phase immunoassays”?
Immunoassays i vilka antigen eller antikropp är bundna till en fast fas så som botten på en ELISA-platta eller en plastkula medan de andra reaktanterna är fria i lösning
Vad är fördelarna av sandwich-ELISA?
Fördelar:
Relativt enkel metod
- Kräver endast spektrofotometer (absorbansmätning) som finns på de flesta laboratorier
- Resultat erhålls snabbt från relativt enkla analysprogram
- Relativt enkelt att själv etablera ny metod
- Relativt billig metod – särskilt egenutvecklade metoder
- Kan vara en känslig metod (inte alltid)
Vad är nackdelarna av sandwich-ELISA?
Nackdelar:
- Analys av ett protein i taget
- Relativt tidskrävande (3h-48h)
- Relativt stora provvolymer krävs – särskilt om flera olika proteiner ska analyseras i samma prov
- Känsligheten kan ibland vara för låg för att kunna detektera alla biologiska analyter
Ge exempel på några ELISA-metoder som används inom klinisk immunologi (alltså inte olika sorters ELISA, utan vad de används för)
- Anti-Neutrophil Cytoplasm Antibodies (ANCA)
- Anti Nuclear Antibodies (ANA)
- Cytokiner (IL-2, IFN-J etc)
Beskriv ImmunoCAP
En ELISA-liknande automatiserad metod som används för analys av allergenspecifika antikroppar (ffa IgE) för att diagnosticera allergier. Analysen visar vilket allergen som patienten reagerar på.
Vad är syftet med att analysera allergenkomponenter (delar av antigen) vid ImmunoCAP?
Det kan bidra till bedömningen av allergins svårighetsgrad då vissa delar ger svårare reaktion än andra.
Vad innebär hydrodynamisk fokusering?
Kulor passerar genom flödescellen och lasern en och en
Hur går den kulbaserade flödescytometriska multiplexanalysen till?
Färgade kulor med bundna antigen + detektionsantikroppar passerar en och en förbi flödescellen+lasern. Fluorescensen från både kulan och de fluorokrominmärkta detektionsantikropparna analyseras
Vilka fördelar finns med kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys?
Fördelar:
- Möjligt att göra multiplexanalys av många proteiner samtidigt (2-500)
- Sparar tid
- Sparar provvolym (25-50 μl krävs totalt för samtliga analyser)
- Ger relativt breda analysintervall – behöver inte göra många olika
spädningar av prov
Vilka nackdelar finns med kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys?
Nackdelar:
- Relativt hög analyskostnad per prov (men ganska billigt per protein som analyseras)
- Kräver tillgång till flödescytometriskt instrument och analysprogram
- Kräver viss analysspecifik kunskap/träning (instrument och analys)
Beskriv metodprincipen för hur låg vs hög koncentration påverkar PE-signalen
Prov med låg koncentration leder till låg mängd bundet IL-6 (tex) till varje kula och därmed låg mängd bundet detektionsantikropp och låg PE-signal (fluorescens).
Prov med hög koncentration ger istället högre mängd bundet IL-6 till varje kula och därmed hög PE-signal (fluorescens).
Vad visar kulans färg respektive PE?
Kulans färg anger vilken analyt som detekteras, medan PE (signalen från antikroppen) anger hur mycket analyt som bundit till respektive kula
Hur bestämmer man koncentrationen i provet (kulbaserad multiplexanalys)?
Man använder standardkurvor (fluorescens x koncentration) och jämför fluorescensen hos det okända provet med standardkurvan för att avläsa koncentrationen
