Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

BMA041 Mikrobiologisk och immunologisk metodik > ELISA och CLIA > Flashcards

ELISA och CLIA Flashcards

1
Q

Vad står ELISA för?

A

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vilka olika varianter av ELISA finns?

A

Direkt, indirekt, sandwich och kompetitiv

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Nämn några användningsområden för ELISA

A

Detektion av antikroppar och antigen:

  • vid bestämning av serumantikroppar
  • vid detektion av virusantigen
  • vid detektion av födoämnesallergener inom industrin

Detektion av olika läkemedel
Vid analys av olika biologiska substanser (tex TNF-alfa, interferoner, hormoner..)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Nämn några djur som man kan få antikroppar från

A

Mus, råtta, kanin, häst, får, get

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Vad är polyklonala antikroppar?

A

Multipla antikroppar som binder till samma antigen (men olika epitoper)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Vad är monoklonala antikroppar?

A

Specifika antikroppar som endast binder till en del av antigenet (en epitop)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Vilka antikroppar används vid ELISA - polyklonala eller monoklonala?

A

Monoklonala

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Hur framställer man monoklonala antikroppar, steg för steg?

A

Först infekteras värddjuret, tex en mus, med antigen. Sedan sker tre saker:

  1. B-celler tas från mjälten. De kan producera AK, överleva i HAT medium men dör efter några dagar
  2. B-cellerna kombineras med cancerceller (kan ej leva i HAT-medium, men kan dela sig obegränsat)
    3: B-cellshybridomen överlever i HAT-medium, delar sig obegränsat och producerar antikroppar som kan skördas
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Vilka olika sätt finns för att framställa B-cellshybridomen?

A
  • Elektrisk cellfusion
  • Polyetylenglykolcellfusion
  • Zendai-virusinducerad cellfusion
  • Optiskt kontrollerad termoplasmonik (nyutvecklad metod)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Ge en kort översikt över stegen i ELISA-metoden

A
  1. Coating av platta (antigen/antikropp)
  2. Blockering
  3. Tillsättning av prov
  4. Detektionsantikropp
  5. Substrat
  6. Avläsning
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Beskriv en ELISA-platta

A

96 hålsplatta

Gjord av plast som binder proteiner effektivt (sätter antigen/antikropp i botten)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Vad används för Coatnings-buffert?

A

Fosfatbuffert (PBS) eller karbonatbuffert.
Viktigt att den inte denaturerar ak/ag samtidigt som bindningen maximeras.
pH varierar, olika ak föredrar olika pH. Dock oftast neutralt

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Vad används för blockering?

A

1% bovin serum albumin
1% torrmjölk
10% kalvserum (FKS)
spädas med PBS/Tween

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Vad är syftet med blockeringssteget?

A

Att se till att inga tomma ytor finns i plasten - förhindrar ospecifik inbindning

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Varför bör proverna spädas innan ELISA?

A

Dels för att spara på prov och dels för att signalen annars blir för stark

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Vilken provtyp används oftast vid antigenmätning?

A

Supernatanter från cellodling eller serum/plasma från patienter

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Hur späds standarden för kvantifiering?

A

Seriespädning av en känd koncentration av antigenet som ska mätas. Spädningen sker i blockeringslösning med Tween

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

När används standardkurva för ELISA? Vilka storheter finns på axlarna?

A

När antigenkoncentrationen ska mätas (Sandwich eller inhibitions-ELISA)

Koncentrationen plottas mot absorbansen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Vad används som negativ kontroll vid ELISA?

A

Bufferten som används för att späda standarden och/eller cellodlingsmedium utan celler (blank).

INGA ANTIKROPPAR

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Vad är detektionsantikroppen för typ av antikropp?

A

Poly- eller monoklonal

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Vad konjugeras detektionsantikroppen med?

A

Vanligtvis med ALP eller HRP (horseradish peroxidase), samt biotin och avidin/streptavidin

22
Q

Varför behövs endast en typ av sekundär antikropp för att kunna binda till många typer av primära antikroppar?

A

Eftersom Fc-domänen på antikroppen är konstant inom samma djurklass så kommer samma sekundära antikropp att kunna binda in till alla primära antikroppar

23
Q

Vilken färg har substratet?

A

Substratet är färglöst

24
Q

Hur färgas produkten i ELISA?

A

Med hjälp av en kromogen som blir färgad när det omvandlas av det konjugerade enzymet

25
Q

Vilken färg får HRP + TMB?

A

Blå

26
Q

Vilken färg får ALP + pNPP?

A

Gul

27
Q

Vilken färg får HRP + ABTS?

A

Grön

28
Q

Vad kan tillsättas som stopplösning för att stoppa färgreaktionen?

A

Fosforsyra

29
Q

Vad används spektrofotometern till i ELISA?

A

För att avläsa hur färgad produkten blivit

30
Q

Vad innebär känslighet vid ELISA? Vad har ELISA för känslighet?

A

Känslighet = den lägsta antigenkoncentrationen som kan mätas, som ger högre absorbans än negativ kontroll

Vid ELISA är känsligheten beroende av vilket antikroppspar som används, men vanligtvis ca 5-10 pg/mL

31
Q

Hur lång tid tar en ELISA?

A 
Coating: över natt
Blockning 1-2h
Provtillsättning, inkubation 1-2h
Detektionsantikropp, inkubation 1-2h
Substrat, inkubation 10-15 min

Totalt: 15-18h

32
Q

Hur går en direkt-ELISA till?

A
  • Bindning av ag/ak direkt till botten i brunnen
  • Märkt primärantikropp
  • Substrat
  • Avläsning med spektrofotometer
33
Q

Vad har direkt ELISA för fördelar och nackdelar?

A

Fördelar:

  • Snabb - bara en AK krävs
  • Liten risk för korsreaktion

Nackdelar

  • Märkt primärantikropp - lägre immunoreaktivitet
  • Dyrt och tidskrävande att märka alla antikroppar
  • Lägre flexibilitet
  • Låg signalstyrka
34
Q

Vad används indirekt ELISA vanligtvis till?

A

Detektion av antikroppar

Provet innehåller eventuella antikroppar som binder till antigen i botten på plattan

35
Q

Vad har indirekt ELISA för fördelar och nackdelar?

A

Fördelar:

  • Stor variationsmöjlighet
  • Många kommersiella märkta sekundärantikropp tillgängliga
  • Ingen märkning av primärantikroppen

Nackdelar:

  • Korsreaktioner kan förekomma
  • Extra inkubationssteg krävs
36
Q

Vad är principen för Sandwich ELISA

A

Två olika antikroppar behövs. En fäst till botten: “capture-antikropp” och en detektionsantikropp som fäster till antigenet (provet) när det väl bundit till capture-antikroppen.

Viktigt att de två antikropparna känner igen olika epitoper på antigenet så de kan binda från varsitt håll

37
Q

Vad har Sandwich ELISA för fördelar och nackdelar?

A

Fördelar:
Hög specificitet – två antikroppar
Passar komplexa prover

Nackdel:
Antigen måste innehålla minst två antikropps-bindningsställen

38
Q

Vad finns det för två olika versioner av kompetitiv ELISA?

A

1) okänd mängd antigen i provet, solid fas med ak

2) okänd mängd antikroppar i provet, solid fas med ag

39
Q

Vid kompetitiv ELISA, vad är enzymaktiviteten proportionell mot?

A

Mängd bundet märkt antigen/antikropp

40
Q

Vad finns det för fördelar med kompetitiv ELISA?

A

Fördelar:
Orena prover kan användas
vid komplexa mixer – kräver ej rening
Hög reproducerbarhet

Nackdelar:
Generellt lägre känslighet och specificitet.

41
Q

Vilka felkällor kan ligga bakom en falskt positiv kontroll? (alltså ett positivt svar på en kontroll som borde varit negativ)

A

otillräcklig tvättning, fel spädning, otillräcklig blockering, kors-reaktion

42
Q

Vilka felkällor kan ligga bakom en falskt negativ kontroll? (alltså ett negativt svar på en kontroll som borde varit positiv)

A

ej korrekt coating,

felaktig ordning på reagenter, icke matchande antikropp, inhiberande kontamination

43
Q

Vilka felkällor kan ligga bakom en svag signal?

A

ej riktig tvättning, otillräcklig
inkubation, inhiberande kontamination, felaktigt substrat, otillräcklig coating, förlust av detektionsantikropp vid tvätt/blockering

44
Q

När används titer för ELISA?

A

Vid dataanalys när man inte kan göra en koncentrationsbestämning (mätning av specifika antikroppar).

45
Q

Vad innebär titer?

A

Titer = den inverterade spädningen där provet har högre signal än bakgrunden (punkten finnes vanligtvis 0,4 absorbansenheter över bakgrunden)

46
Q

Vad står CLIA för?

A

ChemiLuminescence ImmunoAssay

47
Q

Vad är den övergripande principskillnaden mellan ELISA och CLIA?

A

ELISA använder sig av colorimetri för mätning av aktiviteten/inbindningen, medan CLIA använder sig av luminescens.

48
Q

Vad mäts luminescens i för enhet?

A

RLU - relative light units

49
Q

Vad är skillnaden mellan CLIA och CMIA?

A

CLIA använder sig av brunnar (precis som ELISA), medan CMIA istället använder sig av små beads där ak/ag är bundet på ytan

50
Q

Vad står CMIA för?

A

Chemiluminescent Microparticle ImmunoAssay

BMA041 Mikrobiologisk och immunologisk metodik (15 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions