Aspects analytiques en diagnostic moléculaire et pertinence d’utilisation Flashcards
(64 cards)
Quel champs d’application possède récemment un intérêt très fort pour le diagnostic moléculaire?
Microbiologie
Qu’est-ce que la génétique médical? Parle moi de la cytogénétique, génétique biochimique et génétique moléculaire
Spécialité mixte où il y a consultation clinique et réalisation d’analyses biomédicales:
En cytogénétique: Étude microscopique des chromosomes et la chromatine au cours du cycle cellulaire et lors de la mitose
En génétique biochimique: Dosage de substances chimiques dont la concentration peut être modulée par la présence d’une altération dans un ou plusieurs gènes
En génétique moléculaire: Analyse de la structure moléculaire de l’ADN nucléaire ou mitochondrial ou l’ARN associé à une maladie ou à une condition pathologique d’origine génétique.
Qu’est-ce que le diagnostic moléculaire?
Analyse qualitative ou quantitative des acides nucléiques (ARN et ADN) dans un spécimen biologique à des fins de prévention, de dépistage, de diagnostic, de pronostic ou de suivi de l’état de santé des individus
Est-ce qu’il y a une grosse “mode” de faire la pub des analyses génétiques auprès du grand public, et d’en vendre
oui
Parle moi un peu de l,histoire du diagnosic moléculaire
-Gregor Mendel père fondateur de la génétique (1866)
Pose les bases de la génétique et de l’hérédité (hérédité mendélienne): gamète = 1 seule copie de chaque gène, cell somatique = 2 copies
Lois de Mendel explique la transmission des traits (loi de ségrégation, loi de disjonction des allèles, loi de la dominance)
La base biochimique de la transmission demeure totalement inconnue.
-Isolation de l’ADN (1869)
Pour la première fois en 1869 dans les bandages chirurgicaux usagés. Substance riche en phosphore nommé nucléine;
Mise en évidence de la structure en double hélice par James Watson et Francis Crick en 1953;
Théorie fondamentale de la biologie moléculaire par James Watson en 1957
-Invention du séquençage de l’ADN
Première lecture de l’ADN en 1970;
Séquençage Sanger en 1977. Encore utilisé aujourd’hui;
Séquençage du premier génome complet en 1977 (Bactériophage ΦX174);
Séquençage à haut débit (Next Generation “NextGen”)
-Invention de la PCR (Polymerase Chain Reaction) en 1983
Considérée comme une des avancés les plus importantes du 20e siècle;
Prix Nobel de chimie en 1993;
Permet d’obtenir des milliards de brins d’ADN à partir d’un seul brin.
-Publications en diagnostic moléculaire (exponentielle depuis 1970)
Quels sont les niveaux d’organisation de l’ADN?
ADN s’enroule sur les histones = nucléosomes
→ nucléosomes forment structure plus compacte = chromatine
→ Lors de division cellulaire la chromatine devient extrêmement compacte = chromosome (chromatine extrêmement dense)
Combien de paires de chromosomes?
23
Qu’est-ce que le TAAN? Nomme moi des méthodes
Test d’Amplification des Acides Nucléiques
-PCR en point final
-PCR en temps-réel
-Automate de biologie moléculaire
-EBMD moléculaire (développement important suite à la COVID)
C’est quoi le principe de base de la PCR?
-enzyme: polymérase
-produit de départ: produit génomique (ADN génomique)
-1.dénaturation de l’ADN à 94’C
-2.appariement des oligonucléotides à la séquence complémentaire à 55’C
-3.extension à 72’C (produits non définis en longueur)
-4.longs produits → produits courts
-5.produits cours → produits courts (amplification)
Désavantages du PCR en point final
-Faible précision
-Faible sensibilité
-Non-automatisé (maintenant certaines automatisation de la lecture sur gel)
-Grande composante manuelle
-Long
-Pas approprié pour la routine dans un laboratoire clinique
Avantages du PCR en temps réel
-Meilleure précision
-Meilleur sensibilité
-Possibilité de standardisation
-Automatisable
-Rapide
-Peu de manipulation nécessaire
-S’adapte facilement à un laboratoire médical
PCR en point final vs en temps réel
-Le PCR en point final est semi-quantitatif alors que le PCR en temps-réel est quantitatif
-L’analyse est plus longue pour le PCR en point final puisqu’on doit attendre la fin de la réaction
-Le PCR en point final ne peut être automatisé (en règle générale)
-Utilisation d’un agent intercalant cancérigène (artéfact du passé)
-PCR en point final ne peut être utilisé en routine.
Si l’efficacité de la PCR = 100%, de combien augmente la quantité d’ADN à chaque cycle?
on double la quantité d’ADN à chaque cycle
L’efficacité de la PCR dépend de quoi?
Du design des oligonucléotides « primers »
Des conditions et température des cycles
De la présence d’inhibiteurs pouvant limiter l’amplification
Comment le design des oligonucléotides pout affecter l’efficacité de la PCR?
-Une distance courte entre les « primers » = plus petits produits = amplification plus efficace et plus rapide
-Éviter l’auto-appariement des « primers »
-S’assurer de la spécificité. Éviter les séquences répétitives et s’assurer d’éviter séquences similaires non voulues.
L’outil BLAST du NCBI est très utile pour s’assurer de la spécificité
-Longueur optimale entre 18 et 25 bases
-Choisir des « primers » avec température de dénaturation (melting) similaire
Comment les conditions et températures des cycles peuvent affecter l’efficacité de la PCR?
-Performance supérieure si on évite les plateaux de température ou les pauses (permet d’éviter les sous-produits indésirables et augmentation de la spécificité)
–température/période de transition = moins stable en terme de température
–possibilité de création de produits non spécifiques
–diminuer le temps des cycles = moins de sous-produits
-L’efficacité de la PCR augmente si on effectue une amplification rapide
-Les processus sont extrêmement rapides
Est-ce qu’on se retrouve avec des sous produits lorsque la PCR est plus longue ou moins longue?
plus c’est long, plus on a de sous-produits
Comment la présence d’inhibiteurs pouvant limiter l’amplification peuvent affecter l’efficacité de la PCR?
-Des inhibiteurs de PCR peuvent interagir directement avec l’ADN ou d’autres composants et bloquer l’activité de la polymérase (ex: EDTA peut chélater MgCl2).
-Peuvent être retrouvés dans plusieurs types de matrices
–Urine : Sang, Urée, Mucine, Bilirubine
–Endocervicaux/vaginaux: Sang, Mucine, Poudre
–Sang: Hème, IgG
–Nasopharyngé: Différents médicaments, mucine
–Selles : Sels biliaires
–Tubes et préservatifs : Medium de transport viral, héparine, formaline, wabs avec gel ou charbon
Quel est l’avantage de l,amplification isothermale et dans quel appareil on retrouve se type d’amplification?
-Avantages par rapport à la PCR: Pas de nécessité de thermocycleur et peut être très rapide
-appareils = EBMD
Nomme moi 4 techniques d’amplification isothermale
Amplification basée sur la transcription (Transcription-mediated amplification, TMA)
Amplification basée sur le déplacement de brin (Strand displacement amplification, SDA)
Amplification hélicase dépendante (Helicase dependant amplification, HDA)
Amplification médiée par boucle (Loop-mediated Amplification, LAMP)
Explique moi l’amplification basée sur la transcription
-Méthode basée sur la réplication des rétrovirus
-Utilise les activités de transcription reverse, RNAse H (dégrade l’ARN pour laisser simple brin ADN) et ARN polymérase
-Utile lorsque l’ARN est la cible (Exemple: VIH ou HCV)
Explique moi l’amplification basée sur le déplacement de brin
-Requiert la génération de matériel de départ et requiert donc une dénaturation initiale par chauffage
-4 « primers » sont ajoutés: 2 pour le déplacement et 2 pour interne qui ajoutent un site de restriction
-L’amplification exponentielle est effectuée à 37’C en utilisant l’activité d’une enzyme de restriction qui coupe un brin simple
Explique moi l’amplification hélicase dépendante. Quels sont les avantages et inconvénients?
-Utilisation de l’activité ADN hélicase en présence d’ATP
-Séparation des deux brins par adn helicase, ligation des
« primers » grâce a l’ADN polymérase et amplification
-Amplification asynchrone avec cinétique semblable au PCR
-Avantages: application clinique assez courante, faible coût, pas besoin de thermocycleur, développement facile, bonne sensibilité et spécificité, rapide
-Inconvénients: coûts de réactifs (+ que réactifs de PCR)
Qu’elle est la méthode isothermale préférée du prof?
Amplification médiée par boucle (LAMP)
