Aula Prática 1-QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO MÉTODO DE LOWRY Flashcards
(19 cards)
Indique uma vantagem do uso do método de Lowry.
Permite detectar concentrações na ordem dos 0,01 mg de proteína/ml.
Este método é baseado em que reações?
O método de Lowry é baseado em 2 reações.
A primeira consiste na redução do ião Cu2+ em condições alcalinas (básicas), formando um complexo com as ligações peptídicas. É denominada de reação de biureto.
A segunda consiste na redução do reagente Folin-Ciocalteau pelo complexo Cobre-ligação peptídica causando uma mudança da coloração para azul forte.
O que possibilita a quantificação espectrofotométrica?
A coloração que as amostras apresentam após a segunda reação.
Explique a vantagem de se recorrer a métodos de Colorimetria neste protocolo.
Permite detetar e quantificar sustâncias que existem em pequenas quantidades numa mistura complexa.
Neste protocolo em que é que se baseia a identificação e quantificação destes proteínas?
No facto de que cada molécula apresentar um espectro de absorção característico.
Explique o significado de cada valor na Lei de Lambert-Beer.
A = ε C l
A é a absorvância da solução a um determinado comprimento de onda.
ε é o coeficiente de absortividade molar (parâmetro característico da substância a um comprimento de onda definido).
l é o percurso ótico (distância percorrida pela luz quando atravessa a amostra), normalmente 1 cm.
C é a concentração da substância que absorve ao comprimento de onda utilizado.
As biomoléculas absorvem luz a comprimentos de onda característicos. Em que comprimentos de onda absorvem os aminoácidos aromáticos?
280 nm.
O Coeficiente de extinção molar, ε , varia com o quê?
Solvente;
Comprimento de onda;
pH.
De acordo com a Lei de Lambert-Bree, a absorvância ou absorção é indiretamente proporcional à concentração da espécie.
Verdadeiro ou Falso?
Falso, é diretamente proporcional (A = ε C l).
Explique de uma forma geral as principais partes e funcionamento de um espectrofotômetro.
Uma fonte de luz (lâmpada) emite luz ao longo de um amplo espectro, então o monocromador seleciona e transmite luz de um determinado comprimento de onda.
A luz monocromática passa através da amostra em uma cuvette e é absorvida pela amostra proporcionalmente à concentração da espécie absorvente.
A luz transmitida é medida por um detector.
Para estimar a concentração da proteína desejada utilizámos uma reta de calibração com outra proteína cuja concentração já era conhecida, a BSA.
Quanto mais proteína existir na amostra, ……… concentrada será a amostra e …….. o valor da sua absorvância.
Mais; maior.
Explique o uso da solução I (NaOH 1M).
Para que o ião Cu2+ seja reduzido, de maneira a formar um complexo de ligações peptídicas (reação de biureto), é necessário que se adicione NaOH 1 M visto que este é um composto alcalino. O cobre tem a capacidade de reduzir o reagente Folin (reacção Folin-Ciocalteau), reação esta que dará uma coloração à solução, permitindo passar à quantificação espectrofotométrica.
Porque é que após adicionar a solução I é necessário ferver a mistura por 5 minutos?
Acelerar a reação ou desnaturar as proteínas.
Porque é que é necessário incubar as amostras longe da luz?
Devido à adição do reagente, as amostras são fotossensíveis.
Porque é que se mede a absorvância a 750 nm?
O composto produzido após as duas reações tem absorvância máxima aos 750 nm.
As soluções utilizadas neste procedimento foram as seguintes:
Solução I: NaOH 1M
Solução II: NaCO3 2% (p/v)
Solução III: Tartarato duplo de sódio e potássio a 1% (p/v), contendo 0,5% de sulfato de cobre
Solução IV: A 50 ml de solução II adicionar 1ml de solução III
Solução V: Reagente de Fenol (Folin-Ciocalteau)
Explique a utilização e importância de cada uma.
Explique, a nível químico, a primeira reação.
Explique, a nível químico, a segunda reação.
Quais as principais limitações deste método?
Agentes interferentes;
Fotossensível;
Varia com diferentes proteínas.
