Ch 11: la réplication d'ADN Flashcards Preview

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Flashcards in Ch 11: la réplication d'ADN Deck (46):
1

3 modèles de réplication proposés en 1950

-1958, Matthew Meselson et Franklin Stahl étudient ces modèles
-Ils découvrent une façon de distinguer les brins parentaux des brins fils
-L'hypothèse
-Basée sur l’idée de Watson et Crick : l’hypothèse était que la réplication était semi-conservative
fig 11.1

2

trois modèles de réplication - expérience

1) Cultiver des cellules bactériennes sur milieu avec l’N15 (radioactive)

2) Ajouter une solution de milieu frais avec N14 (ou centrifuger et séparer les bactéries et ajouter milieu frais avec N14)

3) Incubation

4) Lyse cellulaire – détergeant (perturber memb)

5) Ajoute solution qui permet de séparer les constituents selon leur taille *gradient de chlorure de césium Csd* et centrifuger

6) Le N 15 est plus lourde/dense que N14; modèle conservatif 2 couches(1 couche très dense N15, 1 couche légère N14-bcp), modèle semi-conservative 2 couches (1 couche semi-dense 50% N15, 50% N14), modèle dispersif 1 couche? (un peu de N15 et de N14)

*on doit prélever un échantillon à intervalles réguliers*
fig 11.2

3

trois modèles de réplication - expérience résultats

fig 11.3
0,3 – peu de bactéries se sont répliqués
1,0 – toutes les cellules ont répliqués; la moitiié (1 brin) de l’ADN est radioactive et l’autre (1 brin) n’est pas
4,0 – bcp plus d’ADN qui est léger puisque le N14 est utilisé plus

4

Initiation de la Réplication- sites de méthylations

fig 11.5
-Le site de méthylation GATC à l’intérieur de l’OriC sont impliqués dans la régulation de la répliation

-Ces sites sont méthylés par DNA adénine méthyl transférase (Dam) (enz)

-Avant la réplication le site GATC sont méthylés dans les 2 brins

-Cette méthylation facilite l’initition de la r.plication à l’origine

-Après la réplication d’ADN les nouveaux brins ne sont pas méthylés

-L’initiation de la réplication d’ADN à l’origine n’a lieu que quand les bases deviennentn méthylées

-Du fait que cela demande plusieurs mn pour dam de méthyler GATC, la réplication ne peut avoir lieu tout de suite

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Initiation de réplication

fig 11.6
-les régions en A-T s’ouvrent puisqu’ils sont plus faibles
-il y a d’autres prots qui ne sont pas indiqués; DNAb (hélicase;déroule/enlève tension) est aidé par DNAc
-Après la séparation de la région riche en A-T, les prots DnaC recrutent l’ADN hélicase au site
-L’ADN hélicase est aussi connue sous le nom DnaB

6

Réplication

fig 11.7

7

Réplication - les protéines

fig 11.8

8

Les ADN polymérases bactériennes

-Catalysent l’élongation de la chaîne d’ADN par l’ajout de nucléotides

-ADN pol I
-Enlève les amorces d’ARN et les remplace avec l’ADN

-ADN pol III
-Synthétise les birns fils dans la direction 5’à3’

-ADN Pol II-IV-V
-Réparation et réplication de l’ADN endommagée

9

les sous-U de ADN polymérise

fig 11.9

10

Les ADN polymérases bact peuvent varier dans leurs sous-U mais: la sous-U catalytique est tjrs semblable

fig 11.10

11

Caractéristiques particulières de la polymérase

Exonucléase est dans le sens 3’-5’
fig 11.11

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Les 2 brins filles sont synthétisés par des mécanismes différentes

-Brin avancé (continue)
-Une amorce d’ARN faite à l’origine
-ADN pol III dait la synt de 5’ à 3’ vers l’ouverture de la fourche de réplication

-Brin retardé (discontinue)
-Synt aussi de 5’ à 3’
-Cependant a lieu loin de la
fourche de réplication
-Plusieurs amorces requises
-ADN pol III synt plusiers petits fragments d’ADN- fragments d’okazakis
-1000 à 2000 pb

13

ADN pol I

-Fonction exonucléase 3’ à 5’ digère l’ARN
-Fonction polymérase 5’ à 3’ insère des nucléotides
-Ne requiert pas d’ATP

14

ADN ligase

-cat ensuite la formation de liaisons phosphodiester entre les fragments d’ADN
-Requiert ATP

15

réplication de l'ADN par polymérise

fig 11.12

16

La synthèse bidirectionnelle du brin retardé et directeur à partir d’une seule origine de réplication

fig 11.13

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Le brin directeur et le brin retardé sont liés par une structure appelée le replisome

-L’ADN hélicase et primase sont physiquement liés les unes aux autres pour formé un complexe; le primosome
-Ce complexe coordine mieux les actions de l’hélicase et la primase
-Ce primosome est physiquement associé avec l’ADN polymérase pour formé cette structure qui est le réplisome
-Les deux prots vont formé une struct dimérique de l’ADN polymérase wui va se déplacer comme une unité vers la fourche de réplication

-Le brin tardif est enroulé (bouclé) pour qu’on puisse atteindre l’autre bout

fig 11.14

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Terminaison de la réplication

-À l’opposé de la séquence de l’oriC du chromosome, se trouvent 2 séq ter T1 et T2

-T1 stoppe la fourche dans le sense contraire des aiguilles d’une montre et T2 stoppe la fourche dans le sens des aiguilles d’un montre

-Des prots tus (termination utilization substance) se lient aux séquences T1 et T2

-Ter + tus bloquent l’avancement de la fourche de réplication

-L’ADN ligas lie de façon covalente les deux brins d’ADN former 2 molécules double brin circulaire
fig 11.15

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Terminaison de la réplication- un dernier problème

fig 11.16
Un dernier problème persiste:

La réplication d’ADN entraine tjrs le formation de 2 molec entrelacées onnues sous le nom caténanes

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Isolement des Mutants

-L’isolement des mutants a été crucial dans la détermination de la réplication d’ADN
-Les mutants ont joué un rôle clé dans ces découvertes
-ADN pol II
-Dif autre enzs impliqués
dans la synt de l’ADN

-La réplication de l’ADN est vitale pour les cellules
-De ce fait les mutations qui bloquent la synt de l’ADN sont létales
-Pour cette raison on devaient chercher les mutants conditionnels

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Isolement des Mutants

-Un type de mutants conditionnels est un mutant sensible à la température (ts)
-Dans le cas d’un gène vital
-Un mutant ts peut survivre à
des températures
permissives
-Mais pas de croissance à
des températures non
permissives

fig 11.17 montre la stratégie utilisée pour isoler ce type de mutants

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Isolement des mutants e.coli

-E. coli a plusieurs gènes vitaux qui sont impliqués dans la réplication:
-De ce fait slmt une partie des mutants ts peut avoir des mutation qui peuvent affecter le processus de réplication

-Les chercheur en 1960 ont analysé des milliers de mutants ts pour connaître ceux qui étaient impliqués dans la réplication

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isolement des mutants- Les mutants dna se divisent en 2 groupes quand ils sont transférés à des températures non permissives:

-Les mutants dna se divisent en 2 groupes quand ils sont transférés à des températures non permissives:
1) certains ont montré un arrêt rapide
-Ces gènes codaient pour
des enzymes utilisés dans
la réplication de lADN

2) d’autres mutants ont pu compléter la réplication mais étaient incapables de commencer une autre
-Les gènes étaient
nécessaires pour l’initiation
de la réplication

-Pour trouver l’enz muté ajouté les enz et voir s’il y a une croissance normale c’est l’enz en question

-Après transfert sur une température non-permissive nous avons arrêt rapide de la synthèse d’ADN – gènes sont nécessaires pour la synt d’ADN

-slow stop mutant – prot mutés sont nécessaires pour l’initiation

Table 11.3 résumé de quelques gènes identifiés par cette stratégie.

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Exemples de ts mutants

fig 11.18
Les gènes étaient désignés par dna suivi par une lettre capitale qui généralement réfère à l’ordre de leur découverte

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Procéssivité de la polymérase III

-L’ADN polymérase III reste attachée à la matrice alors qu’elle synthétise le brin complémentaire

-Cette propriété due à plusieurs sous-u dif de l’ADN polymérase et porte le no de procéssivité

-La sous-u beta forme un dimer en forme de cercle autour de la matrice (clamp protein)

-Une fois liée la sous-u beta peut glisser le long de l’ADN double brin

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Sans vs avec la sous-U  bêta

Sans:
-PolIII se dcroche de l’ADN après avoir incorporé qqs nucléotides
-Vitesse – 20 nucléotides par seconde

Avec:
-Ajoute jusqu’à 500 000 nucléotides
-Vitesse – 750 nucléotides par seconde

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Chimie de la réplication de l’ADN

-Les 2 autres phosphates sont libérés sous forme de Ppi
-L’ADN polymérase cat l’attachement entre le P d’un nucléotide et le sucre de l’autre. Cette liaison nécessit de l’énergie
-Toujours le phosphate le plus interne qui réagit
fig 11.19

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Mécanismes de fidélité

-La réplication d’ADN montre un haut degré de fidélité.
-Les erreurs sont extrêmement rares
-ADN pol III fait slmt une
erreur pour chaque 108
bases
-Plusieurs raisons pour cette fidélité élevée
1- stabilité des paires de bases formées:
2-stucture of config du site actif de l’ADN polymérase;
3-Fonction de relecture de l’ADN polymérase;

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1- stabilité des paires de bases formées:

les paires de bases complémentaires ont une stabilité plus élevé que les paires n’ont appariés; le taux d’erreur pour les paires de bases non appariés 1/1000 nucléotides

30

2-stucture of config du site actif de l’ADN polymérase;

la distorsion de l’hélice causé par le désappariement prévient que le nucléotide soit inséré; se phénomène diminue le taux d’éreur de 1/100 000 à 1 000 000 paires de bases

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3-Fonction de relecture de l’ADN polymérase;

peut identifier les bases mal appariés et les enlèves par son activité exonucléase 3’-5’

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Fonction de relecture (Proofreading) de l’ADN polymérase

fig 11.20

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Réplication de l’ADN des Eucaryotes

-Plus complexe que chez les procaryotes
-Enzymes dans Table 11.1 existent chez eucaryotes aussi
-ADN plus grande
-ADN linéaire
-ADN enroulé en nucléosomes
-Cycle cellulaire plus compliqué

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Plusieurs origines de réplication

fig 11.21

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Origines de réplication (eucaryotes)

-Les origines de réplication chez Saccharomyces cerevisiae sont appelés Éléments ARS (Autonomously Replicating Sequence)
-50 pb
-Riche en AT

-ORC (Origin Recognition Complex)
-Complexe qui démarre la réplication
-Lie les éléments ARS
-Requiert ATP pour se lier

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Origines de réplication - eucaryotes supérieures

-Chez les euc supérieures les carac des origines n’est pas bien défini et comprise chez plusieurs espèces les origines ne sont pas déterminés par une séquence particulière d’ADN mais ont lieu à des sites spécifiques le long du chromosome et qui sont en relation avec la struct de la chromatine (ex: modification des histones)

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débute de la réplication chez les eucaryotes

La réplication commence avec l’assemblement du complexe de pré-réplication (preRC) le complexe preRC est composé de plusieurs prots une partie de ces preRC est un groupe de 6 prots appelé le complexe de reconnaissance de l’origine (ORC) qui agit comme le premier initiateur de la réplication de l’ADN
ORC se lie en premier à l’origine et d’autre prots du preRC se lient incluant un groupe de protéines appelés MCMhélicase. les origines avec MCMhélicase sont capables de commencer le processus de la synthèse d’ADN

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Les Eucaryotes ont plusieurs ADN polymérases

-Les mammifères ont plus d’une douzaine
Table 11.4

-4: alpha, delta, epsilon et gamma ont la fonction primaire de faire la réplication
-a, d et e  ADN Nucléaire
-y  ADN Mitochondriale
fig 11.22(first4)

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Échange de polymérase

-L’ADN polymérase alpha est la seule polymérase qui s’associe avec la primase.

-Le complexe ADN polymérase alpha/primase synthétise une amorce courte hybride ADN/ARN nous avons environ 10 nucléotides ARN suivis par 20-30 nucléotides d’ADN.

-Le complexe polymérase alpha/primase se dissocie de la fourche de réplication et il est échangé par epsilon ou delta,

-l’échange de l’ADN polymérase alpha par epsilon ou delta est nécessaire pour l’élongation des brins retardés et du brin continu.
-Ce phénomène est appelé: échange de polymérase.

-LADN polymérase epsilon est utilisé pour l’élongation du brin continue et l’ADN polymérase delta est utilisé pour l’élongation du brin retardé
fig 11.23

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ADN polymérase béta

-L’ADN polymérase béta est impliqué dans la réparation de l’ADN endommagé (pas impliqué dans la réplication)

-récemment, plusieurs ADN polymérases ont été indentifiés dont le rôle précis n’a pas été identifiée.
-Plusieurs d’entre elles, sont regroupés dans la catégorie ‘lesion replicating polymerase’ (impliqué dans la réplication de l’ADN endommagé)

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Autres différences entre procaryotes et eucaryotes - flap endonucléase

-La flap endonucléase enlève les amorces d’ARN durant la réplication d’ADN chez les eucaryotes
-La polymérase I le fait chez les procaryotes
fig 11.24

42

Télomères et réplication

-Les chromosomes eucaryotes ont des télomères aux extrémités

-Le terme télomère réfère au complexe ADN télomérique et les protéines qui lui sont associées.

-Séquences télomériques
-Séquences moyenenment répétitives en tandem
-Bout cohésif 3’ de 12-16 nucléotides
-Plusieurs guanines et thymines ex) AGGGTT
fig 11.25

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Les séquences télomériques répétés

pas par coeur
fig 11.26

44

L'ADN polymérase présente 2 caractéristiques

1) Synthétise l’ADN aux bouts 5’ à 3’
2)Elles ne peuvent pas initier la synthèse sans amorce

Ces 2 caractéristiques causent un problème au bout 3’ du chromosomes linéaire –le bout ne peut pas être répliqué.
fig 11.27

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Le problème des caractéristiques de l'ADN polymérise

-De ce fait si ce problème n’est pas résolu:
-Le chromosome linéaire devient progressivement court après chaque réplication

-Aussi, la cellule a résolu ce problème:

-Ceci nécessite un mécanisme spécialisé catalysé par une enzyme appelée télomérase

-La télomérase contient des protéines et de l’ARN
-L’ARN est complémentaire à la séquence d’ADN trouvée dans la répétition (séquence répétitives) télomérique
-Ceci permet à la
télomérase de se lier au
bout 3’

-Le mécanisme d’élongation se trouve illustré dans la
fig 11.28

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Longueur de télomère et Cancer

-Les télomères tendent à raccourcir chez les cellules qui se divisent activement.
-ADN télomérique est 8 000 pb à la naissance
-Peut raccourcir jusqu’à 1 500 chez les personnes agés

-Les cellules deviennent sénescentes quand le télomère raccourcit
-Perdent elur habilité à se divisé
-L’insertion de la télomérase hautement active peut bloquer la sénescence

-Les cellules cancéreuses souvent portent des mutations qui augmentent l’activité de la télomèrase.
-Prévient le raccourcissement et la senescence du télomère
-Pourrait être une cible pour le traitement des cancers