Chapitre 1 - La cellule, introduction et méthode d'étude Flashcards
1
Q
De quoi sont constitués les virus?
A
Même matière que les cellules, incapables de vivre indépendamment de cellules hôtes pour se reproduire. Matériel génétique peut être de l’ADN ou de l’ARN.
- Virus qui infectent les bactéries = phages.
2
Q
La cellule eucaryote composition?
Cytosquelette, organites, etc.
A
Cytosquelette: système de filaments (poutres, cordes et moteurs) qui donne à la cellule sa force mécanique qui va guider ses mouvements.
Membrane interne qui délimite ses différents compartiments impliqués dans la digestion et la sécrétion.
Pas de paroi cellulaire, peut modifier sa forme (phagocytose).
3
Q
Théorie de l’endosymbiote
A
Cellule procaryote primordiale (archée) anaérobique capturait d’autre cellules par sa membrane souple et un cytoplasme complexe capable de faire bouger cette membrane.
A capturé une cellule bactérie ancestrale aérobique (pro mitochondrie), ce qui lui a permit d’utiliser l’oxygène pour faire la respiration cellulaire (mitochondrie) ou photosynthèse (chloroplastes)
- Relation symbiotique entre bactérie et archée = cellule eucaryote.
4
Q
Quel type de cellule sert de modèle cellulaire pour l’étude des cellules eucaryotes? et caractéristiques de cette cellule?
A
Levure
- Cellule eucaryote sans le problème du développement multicellulaire.
- Saccharomyces cerevisiae = champignon utilisé pour fabrique bière ou pain
- Se cultive facilement et se divise rapidement
- Se reproduit par voie végétative (simple division - forme diploïde) ou par voie sexué (méiose, forme haploïde)
- génome très petit
5
Q
Quatre espèces utilisées comme modèles d’organismes pour les études en biologie?
A
- Ver nématode, Caenorhabditis elegans
- Mouche, Drosophilia melanogaster
- Souris, Mus musculus
- Humains, Homo sapiens
- en embryologie : aussi la grenouille
6
Q
Quelle est l’utilité d’étudier des cellules?
A
- Les caractériser de façon biochimique, cultiver des cellules pour tester des drogues, étudier la fonction des gènes par transfection, etc.
7
Q
Comment étudier des protéines abondantes dans une cellule?
A
- Directement d’un tissu (d’un type majoritaire) par ex : actine (muscles) et tubuline (cerveau).
- Après amplification en culture primaire (sans autre purification)
8
Q
Dans les étapes pour isoler des cellules, quelles genre de molécules sont utilisés pour défaire la matrice extracellulaire et les jonctions intracellulaires?
Puis, qu’est-il nécessaire de faire si une protéine étudiée est rare ou pour une manipulation génétique?
A
- Enzymes protéolytiques : trypsine, collagénase
- EDTA : Calcium requis pour l’adhésion cellulaire
- Ensuite, séparation par agitation douce.
- Mais pour une manipulation génétique ou si une protéine étudié est rare, il est nécessaire de faire un enrichissement supplémentaire d’un type cellulaire**
9
Q
Comment isoler une cellule d’une population complexe avec la méthode FACS?
A
Cellules d’intérêt séparées par :FACS - Fluorescence-activated cell sorter (cytométrie de flux)
- Anticorps qui reconnaît antigène situé sur un type cellulaire spécifique, couplé à un colorant fluorescent.
10
Q
Comment isoler une cellule avec la méthode de FACS?
A
- Fines gouttes contenant une cellule passent à travers le faisceau d’un rayon laser.
- Les gouttes contenant des cellules fluorescentes sont détectées et chargées négativement.
- Ses gouttes sont déviées par un champ électrique dans un contenant.
FACS détecte un cellule fluorescente sur un pool de 1000 et peut traiter des milliers de cellules par seconde
C’est une sélection positive puisqu’on détecte les cellules marquées.
11
Q
Dans la méthode de purification à l’aide d’un aimant et des billes magnétiques, qu’est-ce que la sélection négative?
A
On marque les cellules qu’on ne veut pas avec des billes magnétiques. Celles-ci sont retirées grâce à l’aimant et on se retrouve avec nos cellules dans le contenant.
Cette méthode permet de purifier un plus grand nombre de cellules plus rapidement
12
Q
Dans la méthode de purification à l’aide d’un aimant et des billes magnétiques, qu’est-ce que la sélection positive?
A
On marque les cellules qu’on veut avec des billes magnétiques et on les retire avec l’aimant pour les placer dans un autre contenant.
Cette méthode permet de purifier un plus grand nombre de cellules plus rapidement
13
Q
Comment fait-on une culture cellulaire?
A
- Cellules dissociées de différents tissus peuvent pousser dans un environnement approprié supplémenté avec 10% de sérum (ex: veau, veau fœtal) et des facteurs de croissance.
- Manipulations de façon stérile dans hotte à flux laminaire.
- Conservés dans un incubateur à 37 C et 5% CO2.
- Congelés en présence de DMSO (cryo-préservateur), gardés dans l’azote liquide (-196C)
14
Q
Différences entre cultures cellulaires in vitro et in vivo?
A
In vitro = en dehors de l’organisme (en biochimie : Dans du verre, dans des tubes en absence de cellules vivantes)
In vivo = Faites dans l’organisme intact (en biochimie : dans des cellules en culture)
15
Q
Dans quel genre de surface les cellules peuvent-elles pousser en culture cellulaire?
A
Surface solide = boîte de culture en plastique traitée spécialement (polystyrène hydrophobe - après traitement chargé +)
16
Q
Qu’est-ce qu’une culture primaire? et avantages?
A
- Cellules isolées directement des tissus
- Lorsque les cellules arrivent à confluence, on les décolle avec de la trypsine, puis on les diluent (culture secondaire) et on les recultive à confluences (passages)
Avantage : Conserve beaucoup les propriétés du tissu d’origine. ex. fibroblaste = collagène, cellules nerveuses= formeront des axones, lymphocytes = stimulés par des antigènes.
17
Q
Désavantages de la culture primaire?
A
- Finissent par mourir
- Ex : fibroblastes cultivés 25-40 passages seulement à cause de :
1. Raccourcissement des télomères (absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines)
2. Choc de culture (activation d’un mécanisme de contrôle du cycle cellulaire)
18
Q
Comment immortalisons nous les cellules? Comment générer des lignées cellulaires?
A
- On réintroduit une télomérase
- Inactivation des contrôles du cycle cellulaire par introduction d’oncogènes
- utilisation de produits chimiques
- Choc de culture peut être évité suite à une mutation durant la culture aussi
19
Q
Qu’elles sont les cellules transformées? et exemple de cellules transformées?
A
- Ce sont des cellules dérivées de tumeurs, produites en introduisant des oncogènes ou infectées par des virus oncogéniques.
- Ex: HeLa (première lignée cellulaire isolée d’une patiente atteinte du cancer de l’utérus)
Propriétés: immortelles, prolifèrent à haute densité, pas besoin d’être attachées pour pousser (pas de boîte de culture), produisent des tumeurs lorsqu’injectées dans des souris.
20
Q
Qu’est-ce que la transfection? et pourquoi est-ce qu’on l’utilise?
A
Procédé par lequel on introduit un acide nucléique (ADN ou ARN) dans des cellules animales en utilisant des méthodes chimiques, physiques ou biologiques (virus)
- Utilisée pour étudier la fonction et la régulation des gènes et pour produire des organismes transgéniques. (efficacité de transfection varie en fonction du type cellulaire et de la méthode de transfection) ex: les cellules primaires sont en général plus difficiles à transfecter.
21
Q
Qu’est ce que la méthode de transfection chimique?
A
On fait rentrer matériel génétique dans une cellule (membrane cellulaire chargée négativevement)
- on neutralise ou on charge positivement l’ADN en le complexant avec du calcium phosphate ou des polycations (l’ADN rentre dans la cellule par endocytose) ou en la complexant avec des lipides pour former des liposomes (endocytose ou fusion avec membrane plasmique)
22
Q
Qu’est-ce que la méthode de transfection physique?
A
- Micro injection (cellules ES) ou électroporation (en utilisant un champ électrique ce qui permet de créer des pores dans la membrane plasmique pour permettre l’ADN d’entrer)
23
Q
Qu’est-ce que la transfection transitoire? Avantages et désavantages?
A
- L’ADN super enroulé (plasmide purifié de bactéries) rentre plus facilement dans les cellules (plus compacte)
- Plasmide entre dans le noyau ou le gène étudié sera transcrit puis traduit.
- Expression élevée pour période de temps limitée, expression maximum après 48-72h, plasmide ensuite dégradé et dilué lors de division cellulaires.
24
Q
Qu’est-ce que la transfection stable? Avantages et désavantages?
A
Nécessite intégration de l’ADN dans le génome de la cellule.
- utilisation d’un gène de sélection qui permet la sélection des cellules en présence de l’ADN intégré.
- Insertion d’un gène de résistance qui s’exprimera de façon transitoire, les cellules ayant intégré l’ADN seront résistante et l’intégrerons à leur ADN et les autres mourront. (ADN intégrée sera transmis aux cellules filles après division cellulaire)
25
Qu'est-ce que la costransfection?
- Gène de sélection et gène de résistance peuvent être portées par le même plasmide ou par plasmide différent (co-transfection).
Dans le cas de la co-transfection, le plasmide qui codera pour la protéine étudiée sera en excès pour augmenter la probabilité que les cellules sélectionnées contiennent les 2 plasmides.
26
Qu'est-ce que la méthode biologique de transfection?
Virus recombinant dérivés de l'adénovirus (ADV), du virus adéno-associé (AAV), du y-rétrovirus (RV) et du lentivirus (LV).
- Plus efficace que les méthodes chimiques/physiques.
*ADV et AA (ADN) pas in vitro car il n'y a pas d'intégration dans le génome
*RV et LV (ARN) transfection stable très efficace.
ADV = expression courte et les autres sont longues.
27
Définition de la transfection
Introduction de matériel génétique dans des cellule de mammifères.
28
Définition de transformation
Introduction de manière non virale d'ADN dans des bactéries, des cellule eucaryotes non-animal et des cellules de plantes. Ce terme désigne le mécanisme par lequel une cellule animale devient tumorale.
29
Définition de transduction
Transfection en utilisant un vecteur viral.
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Culture primaire
Cellules obtenues directement des tissus.
- Lorsqu'arrivées à confluence, cellules diluées = culture secondaire
Peuvent être cultivées des semaines ou des mois mais pas indéfiniment.
Cellules primaires= cellules isolées de tissus sains versus les lignées (cellules malsaines)
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Lignées cellulaires non transformées
Obtenues en immortalisant des cellules en culture primaire. Ne produisent pas de tumeurs lorsqu'injectées dans des souris immunodéficientes.
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Lignées cellulaires transformées
Dérivées de tumeurs (ou générées par l'introduction de certains oncogènes dans des cellules primaires)
- immortelles et produisent de tumeurs lorsqu'injectées dans des souris immunodéficientes.
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Qu'est-ce qu'un anticorps? autre nom? de quelle cellules proviennent-elles? Comment fonctionnent-ils?
Composante du système immunitaire, existent chez tout les organisme qui possèdent un système immunitaire.
- Aussi appelées immunoglobines (Ig)
- produites par les lymphocytes B en réponse à une molécule étrangère ou un microorganisme (antigène)
* Chaque population d'anticorps est générée par une population distincte homogène de lymphocytes B.
- se lient à des antigènes pour les inactiver ou les marquer pour en faire une cible par d'autres composantes du système immunitaire ( ex. macrophage)
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Qu'est-ce qu'un antigène?
Molécule contre laquelle se développe des anticorps.
| Peut générer différent Ac qui reconnaitront des épitopes spécifiques.
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Qu'est-ce qu'un épitope ou déterminant antigénique?
Région spécifique sur l'antigène reconnue par l'anticorps.
Pour protéine, épitope = 5-6 acides aminés
Pour protéine de 150 aa, 30 différents épitopes potentiels et autant de population d'anticorps et de populations différentes de lymphocytes B.
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Qu'est-ce qu'un anticorps polyconal?
Mélange Ac reconnaissante plusieurs épitopes d'un même Ag.
| Chaque population est en quantité limitée.
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Qu'est-ce qu'un anticorps monoclonal?
Reconnaissent un seul épitope, hautement spécifique
38
Comment produisons-nous des anticorps monoclonaux?
En produisant des cellules hybridomes à partir de lymphocytes provenant de souris immunisées contre l'antigène d'intérêt.
Identification des clones positifs en détectant l'Ac dans le surnageant.
Procédure:
- Lymphocytes B contiennent un marqueur de sélection, on mélange cellules différenciées normales avec cellules tumorales de souris.
-Ajout de polyéthylène glycol = hétérocaryon
- Milieu sélectif permettent seulement les hétérocaryons de survivre et proliférer et son ensuite clonées.
39
Utilisation des anticorps monoclonaux?
| Quel type de traitement?
Outils très utilisés en recherche dans les diagnostiques et également dans le traitement de certaines maladies.
ex. Cancer et maladies autoimmunes.
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Comment purifier une protéine?
1. Briser les cellules par choc osmotique, vibration ultrasonique (sonication), broyage avec un mixer.
2. Suspension cellulaire réduite en une bouillie qu'on appelle lysat ou homogénat mais organites restent intacts.
3. Séparation des différents éléments par ultracentrifugeuse selon la taille et la densité des composants. (séparer particules de dimensions très différentes)
éléments plus lourds se retrouvent au fond : le culot
4. Basse vitesse : cellules, noyau (plus lourds)
5. Moyenne vitesse : mitochondries, lysosomes...
etc.
41
Qu'est-ce que le culot?
Éléments les plus lourds qui se retrouvent au fond après ultracentrifugation lente
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Comment effectuer un fractionnement cellulaire?
En appliquant l'homogénat sur le dessus d'une solution de sel qui remplie le tube et un gradient de concentration de solutions de sucrose.
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Sédimentation de vitesse?
Permet une séparation selon la taille et la forme ou le coefficient de sédimentation (valeur S)
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Sédimentation à l'équilibre?
Permet une séparation selon la densité de flottaison indépendamment de la taille et de la forme. En fonction de la densité du composant.
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Différenciation cellulaire?
Processus par lequel les cellules se spécialisent en une type cellulaire.
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Cellules totipotentes (embryon précoce)?
Peut se différencier en tous les types cellulaires embryonnaires et extra-embryonnaires (placenta et cordon ombilical)
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Cellules pluripotentes?
Potentiel de différenciation plus faible que les cellules totipotentes mais peut redonner tous les types cellulaires et un organisme en entier (mais pas placenta ou cordon ombilical)
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Cellules multipotentes?
Potentiel de se différencier en différents types cellulaires à l'intérieur d'une lignée spécifique. Ex: cellules souches hématopoïétiques = leucocytes et érythrocytes.
49
Qu'est ce que la transdifférenciation?
Une cellule qui se différencie à partir d'une autre cellule différenciée sans passer par l'étape de cellule souche.
50
Qu'est ce que la dédifférenciation?
Une cellule complètement différenciée retourne dans un état moins différencié.
51
Qu'est ce que la reprogrammation nucléaire?
Cellule restaurant sa pluripotentialité et le plein potentiel à se différencier dans tous les types cellulaires.
52
Qu'est ce qu'une cellule souche? exemple ? ou les retrouve-t-on?
Cellules non spécialisées totipotentes/pluripotentes/multipotentes (adultes et embryonnaires) desquelles dérivent des cellules spécialisées.
Exemple : les cellules ES et IPS (pluripotentes) réintroduites dans l'embryon: elle redonnent tous les types cellulaires.
Chaque cellule fille issue de la division d'une cellule peut soit rester une cellule souche ou se différencier.
- Se retrouvent en petit nombre dans presque tous les tissus (intestin, peau...)
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Qu'est-ce qu'une cellule souche embryonnaire (ES)?
| D'où provient-elle? de quel type de cellule s'agit-il?
Cellules qui prolifèrent indéfiniment en culture.
Proviennent du bouton embryonnaire ou mase cellulaire interne de l'embryon.
- Elles sont pluripotentes: conservent leur potentiel de différenciation et réintroduites dans l'embryon, elles redonnent tous les types cellulaires (sauf extra-embryonnaires)
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Potentiel en médecine de la cellule ES?
Pour la thérapie cellulaire
- induire la différenciation avec divers hormones ou facteurs de croissance
- Potentiel pou remplacer et réparer tissus malades.
ex. Muscles (dystrophie musculaire)
Cellules nerveuses (parkinson)
Cellules de Langerhans - insuline (diabète)
55
Quelle est la problématique avec les cellules ES?
Problème éthique puisqu'il nous faut un ovocyte.
56
Qu'est-ce que la reprogrammation nucléaire des cellules différenciées?
On transfère les noyaux de cellules adultes différenciées dans des œufs énucléés et on obtient des grenouilles adultes clonées.
-Cellules somatiques différenciées reprogrammées vers un état embryonnaire (pluripotent) en transférant leur noyau dans des oocytes.
Ex. un noyau prélevé d'une cellule différenciée chez une vache adulte et introduit dans un œuf énucléé d'une autre vache produira un veau.
57
Comment Doly la brebis a-t-elle été obtenue?
-Par reprogrammation nucléaire (clonage reproductif)
Obtenue à partir de cellule de glande mammaire de brebis adulte, dont le noyau cellulaire est transplanté dans l'ovule énucléé d'une autre brebis (Belinda) et cela donne naissance à Doly.
58
Problèmes de le reprogrammation nucléaire?
Obtention de cellules pluripotentes requiert des ovules donc ce n'est pas éthiquement acceptable.
59
Qu'est ce qu'une cellule IPS (induced pluripotent stem cells) ?
Cellules pluripotentes produites à partir de cellules somatiques isolées de tissus adultes, réintroduites dans l'embryon, elles redonnent tous les types cellulaires.
60
Comment obtient-on des cellules IPS?
1. À partir de fibroblastes embryonnaires de souris ou du derme humain adulte = cellules somatiques différenciées.
2. Introduire des gènes spécifiques aux cellules ES (facteurs IPS) dans les cellules avec des vecteurs rétroviraux. Cellules expriment les gènes exogènes.
3. Sélection propre aux cellules ES (celles exprimant les gènes exogènes)
4. Obtention de cellules semblables aux cellules ES = cellules IPS.
61
Utilisations de cellules IPS pour guérir des maladies génétiques, quelles sont les étapes? Autres utilisations?
1. Reprogrammation de fibroblastes provenant de souris souffrant d'anémie drépanocytaire en cellules IPS
2. correction de la mutation par technique de remplacement de gènes
3. différenciation de ces cellules en cellule souches hématopoïétiques
4. transplantation dans les souris maladies irradiées et guérison des souris.
* * Utilisation de cellules de la peau pour guérir une maladie qui affecte des cellules sanguine sans immunosuppresseurs!!
- Utilisés pour l'identification de nouveaux médicaments.
- Utilisés pour la correction par thérapie génique (addition ou édition génique)
62
Quels sont les problèmes associés aux cellules IPS?
1. Utilisation des vecteurs rétroviraux (s'intègrent dans l'ADN) ont été remplacés par des vecteurs non-intégratifs (expression transitoire des facteurs de transcription suffisante)
2. Facteurs IPS ont un potentiel oncogénique. Donc elles sont utiles pour l'étude de mécanismes des maladies, criblage de médicaments mais pas la thérapie cellulaire!
3. Il existe une variabilité intrinsèque dans le potentiel de différenciation des différentes lignées de cellules IPS. Donc le phénotype des cellules obtenues de sous-cultures n'est pas nécessairement relié spécifiquement à la cellule affectée dans la maladie étudiée.
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Qu'est-ce que la génétique classique?
À partir d'un phénotype mutant on va identifier la mutation et le gène correspondant.
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Qu'est-ce que la génétique inverse?
Technologie de l'ADN recombinant permet approche inverse à la génétique classique.
- Identifier le phénotype associé à un gène dont on ignore la fonction, en générant des cellules ou des organismes dans lesquels le gène d'intérêt a été muté.
65
Qu'est-ce qu'un organisme transgénique?
Tout animal ou toute plante modifiée génétiquement par la délétion, l'addition ou le remplacement d'un gène.
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Qu'est-ce qu'un transgène?
Tout gène modifié ou ajouté.
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Comment est effectuée la génétique inverse?
Délétion du gène d'intérêt par ciblage génétique (gene targeting). Inactivation génique chez la souris = Souris KO ou gene knock out. Il existe différents types de mutants.
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Mutation KO total?
Les 2 allèles inactivés si non létal.
69
Mutation KO spécifique?
À certains tissus ou à un moment particulier. Ex: gène inactivé seulement dans le foie.
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Mutant ponctuel?
Mutation sur certains AA spécifiques ou certaines régions (modèle de maladie génétique)
71
Remplacement de gène?
Fusion du gène avec le gène qui code pour la GFP qui permet de suivre son expression in vivo.
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Qu'arrive-t-il aux gènes silencieux dans les cellules différenciées?
Gènes silencieux dans des cellules différenciées peuvent être réactivés, expression de gènes dans les cellules différenciées demeure dynamique et réversible!
73
Étapes du ciblage génique chez la souris par recombinaison homologue.
1. introduction d'ADN dans des cellules modifiées contenant des séquences d'homologie avec le gène ciblé = mène à recombinaison homologue
2. ADN transféré s'insère dans chromosome au hasard.
3. ADN remplace copie du gène homologue par recombinaison homologue.
4. cellules dans lequel cela ce produit = sélectionnées.
5. N'importe quel gène peut être ainsi ciblé, modifié, inactivé.
6. si 2 copies du gènes sont inactivées, l'animal qui en résulte = KO
74
Comment obtenir un souris avec une copie d'un gène modifié dans toutes ses cellules?
Recombinaison homologue.
- Sélection des cellules portant gène altéré suite à la recombinaison.
- Injection cellules mutées dans blastocystes, ce qui incorpore le gène muté dans une souris adulte
- Croissement avec souris normale
- obtention souris portant une copie du gène modifié dans toutes ses cellules
75
Qu'est-ce qui arrive si on croise 2 souris génétiquement modifiées? combien de descendants homozygotes/hétérozygotes?
1/4 descendants homozygotes.
76
S'il y a délétion d'un gène dans toutes les cellules d'un organisme quel genre d'animal cela peut-il créer?
Animal KO (knock-out)
77
Quelle est la différence entre la recombinaison homologue et l'intégration aléatoire?
Recombinaison homologue vise une partie précise de l'ADN à remplacer tandis que l'intégration aléatoire fait le tout au hasard, plusieurs parties de l'ADN peuvent être modifiées.
78
Qu'est-ce que le système Cre-Lox?
Insertion de 2 types d'ADN dans les cellules germinales de 2 souris.
79
Dans le système Cre-Lox, que fait la recombinase Cre ? Sous quel contrôle est-elle? Quand est-elle active?
Sous le contrôle d'un promoteur spécifique à un tissu en particulier. (par exemple : le foie)
OU
Actif seulement durant une période spécifique du développement
80
Dans le système Cre-Lox, comme fait-on pour supprimer un gène d'intérêt
Grâce à la recombinase Cre, le gène d'intérêt est flanqué des sites de reconnaissances (LoxP). Donc, on remplace le gène endogène par un autre gène.
Le gène endogène sera supprimé uniquement dans le foie.
81
Que fait la recombinase Cre dans le système Cre-Lox
Elle permet le remplacement du gène endogène que l'on désire supprimer.
82
Ou agit le système Cre-Lox, sur quel tissue spécifique?
Tissue du foie
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Nommer une façon rapide d'étudier la fonction d'un gène.
L'interférence par l'ARN (RNAi)
84
Comment fonctionne l'interférence par ARN?
1. ARN interférents produits à partir d'ARNdb.
2. Ils localisent leur ARN cible par appariement des bases.
3. Inhibition de la traduction et/ou destruction de l'ARN.
85
Limitations de l'interférence par l'ARN?
1. N'inactive pas de façon efficace tous les gènes.
| 2. Certains tissus sont résistants.
86
L'interférence par l'ARN facilite qu'elle autre méthode de génétique?
La génétique inverse.
| -Détermination de la fonction d'un gène en l'inactivant et en observant le résultat.
87
Quelle est l'efficacité de l'obtention d'un KO par recombinaison homologue dans les cellules ES? et pourquoi?
Très peu efficace.
-Plusieurs cellules doivent être criblées pour en trouver une rare dans laquelle le gène cible a été remplacé correctement.
88
Qu'est ce qui peut augmenter l'efficacité de la recombinaison homologue?
Cassure double brin.
89
Quels sont les 3 systèmes pouvant induire des cassures double brins à l'ADN et ainsi faire l'édition du génome?
ZFN (Zinc Finger nucleases)
TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)
CRISPR (Courtes répétitions en palindrome regroupées et régulièrement espacées), avec nucléase Cas9
90
Comment agissent ZFN et TALEN?
Combinaison de séquences spécifiques d'ADN avec une nucléase qui va être fonctionnelle sous forme dimérique.
91
Quelle est la composition de CRISPR?
Courtes répétitions en palindromes regroupées et espacées avec fragments d'ADN ressemblant à une bactériophage entre les séquences palindromiques.
92
Quelle est la fonction de CRISPR?
Système immunitaire bactérien qui permet de lutter contre les bactériophages.
93
Étapes de l'action de CRISPR
1. Après infection, morceau d'ADN du virus à proximité de séquence PAM est inséré dans le locus CRISPR
2. L'ARN est transcrit, maturé et s'associe à une protéine Cas9
3. Lors d'infections subséquentes par virus, la bactérie est maintenant vaccinée et l'ADN phagique est détruit par l'ARN complémentaire associé à une Cas9.
94
Quelle est la fonction de la séquence PAM adjacente à la séquence cible dans le locus CRISPR?
- requise pour la coupure par la Cas9 de l'ADN du virus
| - Permet à la bactérie de différencier son génome de celui du phage.
95
Qu'elle est la fonction de l'ARN guide dans CRISPR? (3)
1. ARN guide spécifiquement conçu associé à Cas9, se lie à une séquence spécifique d'ADN et la coupe.
2. ARN requise pour association avec Cas9
3. Autre portion de l'ARN reconnaît séquences dans le génome.
96
Différence entre ZFN,TALEN et CRISPR?
ZFN et TALEN reconnaissent séquence d'ADN à cliver avec protéine nucléase tandis que dans CRISPR c'est l'ARN qui reconnaît les séquences d'ADN à cliver.
97
Quels sont les avantages du système CRISPR/Cas9 ? (3)
1. Plus simple, plus rapide et plus économique que TALEN et ZFN
2. Adaptée aux approches de criblage de nombreuses cibles.
3. Possibilité d'utiliser multiples séquences d'ARN guide pour modifier simultanément plusieurs locus différents dans un même génome.
98
Quelles sont les 2 méthodes de réparation d'ADN après une cassure double brin?
1. NHEJ ( réparation par jonction d'extrémités non homologues - non homologous end joining)
2. HDR (Réparation par recombinaison homologue - homology-directed repair).
99
Pourquoi utiliser la méthode NHEJ?
- Restaure la continuité de l'ADN endommagé
- Utilisée pour inactiver des gènes.
- 2 extrémités cassure sont rattachés ensemble
100
Désavantages de la méthode NHEJ?
Introduit des indels : insertions ou délétions donc ne restaure pas la séquence initiale.
- altération de la séquence d'ADN en réparant la cassure.
- quelques nucléotides insérés ou supprimés au hasards parfois = formation produit tronqué
101
Pourquoi utiliser la méthode HDR?
- Restaure la séquence originale de l'ADN
- Inclusion d'ADN homologue lors de la réparation pour modifier le génome avec précision ou pour insérer de l'ADN exogène.
- mutations ou segments d'ADN exogènes peuvent être incorporés si elles ont un gabarit d'ADN homologue avec séquences adjacentes à CDB
102
Comment se fait l'inactivation d'un gène de façon classique?
Recombinaison homologue
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Est-ce nécessaire d'effectuer de la recombinaison homologue après un coupure à l'ADN?
NON (méthode de NHEJ = recombinaison par jonction d'extrémités non homologues)
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Quand est-ce que la HDR effectue son travail?
Une foie que la réplication est complétée, donc lorsqu'un duplex d'ADN est disponible comme gabarit.
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Qu'est ce que permet d'insérer l'ADN fourni en trans? (3)
Séquences d'ADN:
| -soit d'un allèle conditionnel, d'une étiquette fluorescente ou d'une mutation spécifique.
106
Étapes de cassure double brin et réparation avec méthodes ZFN, TALEN, CRISPR.
1. Nucléase introduite dans cellule cible séquence d'ADN spécifique, introduit cassure double brin (CDB)
2. Mécanismes de réparation intracellulaires de l'ADN sont activés : NHEJ ou HDR
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Quelles sont les utilités de CRISPR/Cas9 pour étudier la fonction des gènes?
1. Remplacement de gène avec gène muté (en fournissant ADN gabarit en trans)
2. Utilisation protéine Cas9 mutante (dépourvue activité nucléase et fusionnée à domaines protéiques d'activation ou inhibition de transcription) pour activer ou réprimer des gènes.
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Comment introduire système CRISPR/Cas9 dans cellules? (4 méthodes différentes)
1. Transfection plasmide (ARN guide + Cas9)
2. Vecteurs viraux avec vecteurs non-intégratifs
3. Transfection de Cas9 ARNm et ARNg
4. Transfection d'un complexe ribo-nucléoprotéique (ARNg + protéine Cas9)
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Est-ce que l'expression transitoire ou l'expression continue de Cas9 et ARNg est préférable?
L'expression transitoire est suffisante et préférable puisque l'expression continue de Cas9 et ARNg va augmenter les coupures hors sites.
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Avantages de l'utilisation de CRISPR/Cas9 pour générer des souris KO?
1. Plus besoin de passer par les cellules ES.
2. Injection directement dans l'œuf fertilisé (même stratégie pour générer une souris transgénique)
3. Gain de temps important!
4. Réaliser un double KO facilement et rapidement.
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Étapes de génétation de souris double KO avec CRISPR/Cas9
1. Prendre ovule fécondé de souris et introduire ARNg et Cas9
2. Réimplanter ovule dans souris
3. ARNg va reconnaître séquence spécifique du gène à inactiver et Cas9 va couper.
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Quelles protéines sont fusionnées au domaine nucléasique de Fokl?
ZFN et TALEN - protéines liant l'ADN
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Quel système est composé d'un assemblage nucléique contenant une ARN et une nucléase?
CRISPR/Cas9
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Vrai ou faux: Les méthodes d'édition du génome ZFN, TALEN et CRISPR/Cas9 sont retrouvées in vivo.
Faux
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Quelle est la différence entre la résolution et la détection?
Un petit objet sous la limite de résolution peut être détecté s'il émet de la lumière.
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Les molécules fluorescentes GPF sont-elles endogènes ou exogènes?
Endogènes
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Les Ac couplés à une molécule fluorescente ou molécule s'intercalant dans l'ADN comme le DAPI, sont-ils endogènes ou exogènes?
Exogènes
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Définition de fluorophore
Substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur d'onde.
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Est-il possible de détecter différentes molécules dans la même cellule au microscope?
Oui en couplant différents Ac à différents fluorochromes.
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Vrai ou faux: La GFP permet l'observation de cellules vivantes et la visualisation de structures.
Vrai
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Quelle est la différence entre l'immunocytochimie et l'immunohistochimie?
Les 2 sont des méthodes de détection d'un antigène à l'aide d'un Ac couplé à une enzyme ou un fluorochrome.
Immunocytochimie = dans les cellules
Immunohistochimie = dans les tissus
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Qu'est-ce que l'immunofluorescence?
Ac est lié à un fluorochrome permettant de visualiser et/ou quantifier l'antigène cible.
-L'immunofluorescence est un type d'immunohistochimie (mais lorsque anticorps lié à fluorochrome et non enzyme)
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Pourquoi utiliser l'immunofluorescence indirecte?
Amplifier le signal (si anticorps secondaire est polyclonal - plusieurs anticorps marqués se fixent sur Ac primaire) ou si l'Ac primaire marqué n'est pas disponible.
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Qu'est-ce que l'immunofluorescence indirecte?
Ac primaire reconnaît antigène et anticorps secondaire couplé à fluorophore reconnaît antigène primaire.
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La transferrine permet de marquer spécifiquement quelle structure?
Endosomes
| - Elle se fixe sur son récepteur et est ensuite endocyté.
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3 différentes manière de marquer un nucléotide?
1. Avec un fluorochrome
2. Nucléotide marqué à la digoxigénine et reconnue par un Ac couplé à une molécule fluorescente (FISH)
3. Nucléotide marqué à la digoxygénine et reconnu par Ac couplé à une enzyme.
4. Marqué avec radioisotope (autoradiographie)
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Utilisations de FISH? (2)
sondes ADN ou ARN marquées avec des fluorochromes différents pour localiser des gènes sur des chromosomes.
- Diagnostique de la leucémie myéloïde chronique.
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Quels sont les avantages des quantum dots?
Fluorescence plus stable et émettent différentes couleurs.
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Qu'est ce qu'un point quantique?
Nanoparticules (2-10 nM) fait de séléniure de Cd. Ils peuvent être couplés à des anticorps et lier des protéines cibles.
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Qu'est-ce que la déconvolution d'image?
En microscopie à florescence, permet l'obtention d'une image en 3D par ordinateur, beaucoup moins floue.
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Quelles sont les 2 solutions afin d'obtenir une image en 3D d'un échantillon?
1. Par ordinateur = déconvolution
| 2. Par optique = microscope confocal à balayage laser
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Fonctionnement du microscope confocal à balayage laser?
- Laser balaie le spécimen dans toute son épaisseur et sa largeur, centre faisceau lumineux sur un point à une profondeur précise du spécimen.
- Forme une image composite de l'ensemble de la cellule ou d'un plan très mince de la cellule
- Utilise la fluorescence, détecte seulement la fluorescence des plans en foyer (pas hors foyer)
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Pourquoi utilisons-nous la GFP?
- Fluorescente de façon inhérente
- molécule-rapporteur pour suivre l'expression des gènes
- Fusion avec peptide signal de localisation pour diriger l'expression vers un organite spécifique et étudier la distribution et la dynamique.
- Permet d'identifier quand et ou (quels tissus) un gène est exprimé, ou comment sa localisation change en réponse à des stimuli.
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Exemple d'utilisation de la GFP
- observation du rétrovirus recombinant ayant le spike de la SARS-CoV-2 à sa surface. (transfecter gènes qui codent pour virus et GFP dans cellule)
- Tester des drogues et des vaccins
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Qu'est-ce que la méthode FRET?
Permet de suivre les interactions entre 2 protéines
ex. Prot X couplée à GFP excitée au violet, émettant bleu
Prot Y avec GFP excite en bleu, émet vert
Si X et Y sont suffisamment proche suite à une interaction, excitation violet = vert.
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Qu'est-ce que la photoactivation?
- Fait intervenir une forme inactive d'une protéine fluorescente qui est activée à une endroit spécifique par un rayon lumineux.
- Permet de caractériser le déplacement d'une protéine GFP, sa demi-vie et les sentiers impliqués dans sa dégradation.
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Qu'est-ce que le FRAP?
- Éteint la fluorescence de la GFP avec puissant rayon laser dans une région spécifique.
- Permet l'analyse du déplacement des molécules fluorescentes restants dans la région blanchie.
- Donne informations sur cinétique de la protéine
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Qu'est-ce que l'immunobavardage ou Western Blot?
Technique utilisée pour la détection et quantification des protéines.
Permet la séparation et identification d'un protéine d'intérêt spécifique dans mélange complexe de protéines.
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Quelles sont les étapes de l'immunobavardage?
1. Séparation protéines par électrophorèse sur gel (en fonction de leur charge, taille, migration à travers gel par application champ électrique)
2. Transfert protéines sur support solide (membrane)
3. Détection de la protéine cible (avec anticorps primaires ou secondaires et immunofluorescence)
4. Visualisation protéine cible
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Qu'est-ce que l'immunoprécipitation?
Technique permettant précipitation d'un antigène en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement cette protéine.
-Purifie une petite quantité d'enzyme d'un extrait de cellules pour l'analyse enzymatique ou pour étudier les protéines associées.
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Étapes de l'immunoprécipitation
1. Petite qté de billes liés à un anticorps est ajouté à un extrait de protéines et mélangé en suspension.
2. Les anticorps se lient aux antigènes désirés.
3. Les billes (non-liées) sont récupérées par centrifugation à basse vitesse et les protéines (antigène) non-liées sont rejetées.
