Chapitre 2 Flashcards
Qu’est-ce que la chromatographie?
Méthode utilisée afin de séparer des mélanges complexes
Qu’est-ce que la phase mobile?
Le mélange des substance à fractionner
Qu’est-ce que la phase stationnaire?
À travers de laquelle les substance seront séparées
Quelles sont les propriétés utilisées afin d’effectuer le fractionnement?
- Les interactions ioniques
- La taille
- La spécificité
L’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de quoi?
- Le pH de la solution, puisque la charge nette des protéines dépend du pH
- La concentration et la nature des autres ions en solution puisqu’ils vont également compétitionner pour le site de liaison de l’échangeur d’ions.
Quelles sont les deux caractéristiques des échangeurs d’ions?
- La nature de leur matrice
- Le groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine
Les matrices en chromatographie sont composées de quoi?
Polymères insolubles, préparés sous forme de billes (également appelées résines)
Quels sont les polymères les plus utilisés dans les matrices?
- La cellulose ou des dérivés de cellulose (agarose ou autres polymères)
- Perles céramiques rigides (silica)
Quelles sont les deux classes d’échangeurs?
1- échangeurs cationiques (charges négatives)
2- échangeurs anioniques (charges positives)
Quelles sont les groupements chimiques greffés sur les matrices?
1- QAE = amine quaternaire = anionique fort
2- Sulfonates = cationique fort
3- DEAE = amine tertiaire = anionique faible
4- CM = carboxyméthyle= cationique faible
Expliquer le principe de liaison à la colonne?
1- Les protéines se lient à l’échangeur grâce à des forces électrostatiques
2- Les charges de l’échangeur sont contre balancées par des contre-ions
3- La protéine doit déplacer ces contre-ions afin de s’attacher
4- Comme la protéine peut être neutralisée par les contre-ions, elle doit avoir une plus grande affinité pour l’échangeur d’ions que pour les contre-ions.
5- Régulation du pH et de la concentration saline afin que la protéine reste immobile à son échangeur
Expliquer le principe d’affinité des protéines avec l’échangeur d’ions (procédure de lavage)?
Les protéines qui n’ont pas d’affinité avec l’échangeur d’ions migreront en premier et se retrouveront en bas de la colonne.
Plus l’affinité est importante, plus la migration sera retardée
Quel est le moyen afin de procéder à l’élution (détachement) des protéines attachées à l’échangeur?
Utiliser une tampon ayant une concentration saline supérieur à celui du tampon de lavage
Quels sont les principaux sels utilisés afin de procéder à l’élution?
Le KCl et NaCl
Expliquer le principe de gradient linéaire?
Faire varier la concentration en sel présente dans le tampon de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne afin de libérer les protéines attachées à l’échangeurs d’ions
Qu’est-ce que la chromatographie par gel-filtration?
Sert à séparer les protéines selon leurs tailles à l’aide d’un tamis moléculaire.
VRAI OU FAUX
Les protéines plus petites passeront beaucoup plus rapidement à travers la colonne
FAUX
Ce sont les protéines les plus grandes, car elles seront exclus de la plupart des pores et se déplaceront plus rapidement à travers la colonne.
De quoi est constitué la phase stationnaire dans la chromatographie sur gel-filtration?
Un réseau de polymère réticulé possédant des pores
Qu’est-ce que la limite d’exclusion?
Les pores sont suffisamment gros afin de passer les petites protéines, mais empêcherait le passage des grosses protéines de certaines tailles.
De quoi sont faites les matrices?
Polymères insolubles à base de polysaccharides comme le dextrane, l’agarose, le polyacrylamide (préparées sous forme de billes réticulés)
La porosité du gel dépend de quoi?
1- de la masse moléculaire du polymère
2- du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules des polymères
Qu’est-ce que le volume d’élution d’une protéine?
C’est le volume de solvant nécessaire afin d’éluer une protéine après son dépôt sur la colonne
Que permet de mesurer le volume d’élution relatif (Ve/Vo)?
La masse moléculaire de la protéine
Quelle relation mathématique existe entre le volume d’élution relatif et le logarithme de la masse moléculaire de la protéine?
Une relation linéaire
