cours 1 Flashcards
(94 cards)
1
Q
quelles sont les enzymes étudiées ?
A
- protéases
- ribonucléase
- activité GTPase des protéines G
2
Q
exemple de protéases ?
A
- protéase à
- sérine
- cystéine
1.métallo-protéase
3
Q
exemples de ribonucléases
A
- ribonucléase protéiques
- ribozymes
4
Q
quel est l’une des réactions enzymatiques les plus fréquentes chez les protéines ?
A
le clivage peptidique
5
Q
quels sont les premiers catalyseurs biologiques à être purifiés et caractérisés ?
A
les protéases
6
Q
quels sont les fonctions des protéases ?
A
- Digestion
- Clivage de précurseurs hormonaux
- Clivage de précurseurs viraux (exemple: VIH, SARS-CoV-2)
- Coagulation du sang
- Dégradation des protéines cellulaires
7
Q
pour quelle matières les détergents avec des enzymes ne sont pas recommandés ?
A
- laine
- soie
- cachemire
- autres textiles contenant des protéines
8
Q
vrai ou faux ? toutes les protéines catalysent la même réaction
A
vrai, mais utilisent divers mécanismes pour y arriver
9
Q
que font elles endopeptidases ?
A
elles rompent les liaisons internes, permettant une hydrolyse limitée
10
Q
que font les exopeptidases ?
A
elles clivent les liaisons peptidiques N- ou C-terminal, entraînant la dégradation
11
Q
sur quelle base les protéases peuvent être classées en diverses familles ?
A
sur la base de leur site actif, leur mécanisme d’action, et leur structure tertiaire
12
Q
selon le mécanisme protéolytique, les protéases se divisent en 6 grands groupes ou classes mécanistiques générales) et de nombreuses familles de protéases. quels sont-ils ?
A
• les protéases à sérine
• les protéases à thréonine
• les protéases à cystéine
• les protéases à acides aspartiques
• les métalloprotéases
• les protéases à acides glutamiques.
13
Q
c’est quoi le site catalytique (parfois site actif) ?
A
région de l’enzyme contenant les groupements catalytiques directement impliqués dans la réaction chimique
14
Q
c’est quoi le site de spécificité (de reconnaissance ou de liaison) ?
A
il est défini par les résidus de l’enzyme qui viennent en contact avec le substrat et qui forment la région où le substrat se lie à l’enzyme.
15
Q
c’est quoi un sous-site ?
A
région de l’enzyme qui interagit avec un acide aminé du polypeptide.
16
Q
vrai ou faux ? Un sous-site correspond à une série continue d’acides aminés mais ne peut être formé de résidus qui sont adjacents dans la séquence de l’enzyme.
A
faux. un sous-site ne correspond pas à une série continue d’acides aminés mais peut être formé de résidus qui ne sont pas adjacents dans la séquence de l’enzyme.
17
Q
que peut catalyser la chymotrypsine ?
A
l’hydrolyse des liens amides et esters situés du côté C terminal des résidus Tyr, Trp, Phe et Met
18
Q
qu’est ce qui a été utile à l’élucidation du mécanisme de la chymotrypsine ?
A
l’activité estérase
19
Q
quel est le substrat ester de la chymotrypsine ?
A
l’acétate de para-nitrophényle
20
Q
lorsque la liaison ester du PNPA est coupée deux produits sont générés. quels sont-ils ?
A
- l’ion p-nitrophénolate
- l’ion acétate
21
Q
quelle est la phase rapide de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine ?
A
la libération initiale du p-nitrophénolate
22
Q
quelle est la phase stationnaire de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine ?
A
la formation de l’ion acétate
23
Q
qu’est- ce qui permet de définir la concentration initiale d’enzyme active ?
A
l’extrapolation au temps zéro des courbes de l’état stationnaire
24
Q
l’extrapolation au temps zéro: ~0.63 mol de p-nitrophénolate est produit par mole
d’enzyme. quels sont les 2 explications possibles ?
A
- soit que la forme active est pure à 63 %
- soit que la constante de formation de l’acyl-enzyme n’est pas beaucoup plus grande que la constante de déacylation et ne permet pas à l’acyl-enzyme de s’accumuler entièrement
25
c'est quoi le cas où k2 >>>k3 ?
lors de l’hydrolyse de la liaison ester du PNPA, la formation rapide de l’intermédiaire acyl-enzyme est suivie d’une plus lente libération du produit P2. Un tel profil enzymatique est caractéristique d’un mécanisme à 3 étapes.
26
c'est quoi le cas où k2<<
il est important de comprendre que lors de l’hydrolyse d’une liaison amide par la chymotrypsine un profil enzymatique différent est observé; la formation de l’intermédiaire intermédiaire acyl-enzyme est alors l’étape limitante de la réaction .
27
combien de résidus sérine contient la chymotrypsine ?
27 résidus sérine
28
quel résidus de la sérine de la chymotrypsine réagit avec le DFP ?
le résidu 195
29
comment le DFP inactive les autres protéases à sérine ?
en faisant une liaison covalente avec la sérine au site actif (attaque nucléophile)
30
quel type d'inhibiteur est le DFP ?
inhibiteur irréversible de type « suicide ». Il n’est plus utilisé car très toxique.
31
quels sont les 2 inhibiteurs mortels de l’acétylcholinésterase ?
1. gaz sarin
2. DFP
32
quels sont les inhibiteurs spécifique des protéases à sérines ?
- fluorure de phénylméthanesulfonyl (PMSF)
- DFP
- L’AEBSF (meilleur alternative) (+soluble et +stable dans l'eau et moins toxique)
33
par quoi la chymotrypsine est inactivée lors d'une implication de His57 ?
par le TPCK (N-tosyl-L phénylalanylchlorométhylcétone)
34
qu'est-ce qui a permis de démontrer l'existence et la disposition de la triade catalytique ?
la structure cristalline de la chymotrypsine
35
quels sont les rôles de His57, Ser195 et Asp102 lors de la triade catalytique ?
- His57: Base et acide général (accepteur et
donneur de proton)
- Ser195: Responsable de l’attaque nucléophile
- Asp102: Stabilise le bon tautomère de His57 et le maintient dans la bonne position
36
quels sont les évidences du LBHB ?
1. Signal RMN du 1H à très bas champ
2. Interaction avec les composés peptidyl trifluoromethyl ketones
3. LBHB stabilise l’état de transition de la réaction et abaisse l’énergie d’activation en augmentant la basicité de His57
37
comment le rôle de l'Asp102 a été vérifié ?
par mutagenèse dirigée: on a remplacé l’Asp102
par un résidu isostérique non chargé: l’ Asn.
38
qu'est ce qui diffère de l'enzyme sauvage du mutant Asp102Asn ?
- propriété cinétique différents
- Km pas très différent
- Kcat diminue d'un facteur de 5000
39
vrai ou faux ? le résidu Asp102 est important pour la catalyse enzymatique, mais pas absolument nécessaire
vrai
40
vrai ou faux ? Asp102Asn réagit 10 000 fois plus vite avec le DFP
faux, Asp102Asn réagit 10 000 fois MOINS VITE avec le DFP
41
où se situe l'effet principal de la mutation de l’Asp102 ?
au niveau de la réactivité de la Ser195. l’Asp102 confère à la Ser195 son caractère nucléophile élevé.
42
quels sont les étapes d'acylations et de déacylation?
les étapes 1-3 et 4-7
43
que permettent les étapes 1-3 d'acylation ?
la formation d’un intermédiaire acylé.
44
que permettent les étapes 4-7 de déacylation ?
permettent à l’enzyme de
- libérer le produit clivé
- de récupérer son état actif initial
45
quels sont les 7 étapes de la réaction catalysée par la chymotrypsine ?
1. formation du complexe E-S
2. attaque nucléophile de la Ser195 sur le carbonyle du substrat
3. bris du lien peptidique du substrat avec libération d’un produit amine
4. liaison d'une molécule d'eau
5. attaque de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau
6. conversion en produit
7. régénération de l'enzyme
46
c'est quoi la formation du complexe E-S ?
- substrat se positionne au site actif de façon favorable
- chaîne latérale de la Phe se place dans une cavité hydrophobe
47
c'est quoi l'attaque nucléophile de la Ser195 sur le carbonyle du substrat
- transfert de proton de la Ser195 à l’His57 (catalyse basique)
- production d'un intermédiaire tétraédrique avec une charge négative sur le O du C=O (intermédiaire stabilisé par des ponts hydrogène dans la cavité
oxyanionique)
48
c'est quoi l’étape du bris de liaison peptidique du substrat avec libération du produit amine ?
- transfert de proton de l’His57 (catalyse acide) au produit
- intermédiaire acyle-enzyme obtenu
49
c'est quoi la la liaison du H2O ?
- se lie à l’intermédiaire acyl-enzyme de façon favorable à la réaction
50
c'est quoi l'attaque de l’acyl-enzyme par une
molécule d’eau ?
- formation d'un nouvel intermédiaire tétraédrique de
courte durée
- cette attaque est facilitée par une catalyse basique de l’His57 (transfert de proton de la molécule d’eau
au His57)
51
c'est quoi la conversion en produit ?
- intermédiaire tétraédrique converti en produit
- conversion est facilitée par une catalyse acide de l’His57 (transfert de proton de His57 à Ser195)
52
c'est quoi la régénération de l'enzyme ?
- libération du second produit
- régénération de l'enzyme libre
53
quel est le mécanisme des protéases à sérine ?
mécanisme ping pong
54
c'est quoi un zymogène ?
précurseur protéique inactif d'une enzyme
55
que permet le zymogène ?
d'effectuer un clivage protéolytique à un moment et/ou endroit précis pour réguler des processus cellulaires
56
exemples de processus cellulaire impliquant des zymogènes ?
- digestion
- coagulation du sang
- réponse hormonale
- l'apoptose
57
lors de la digestion, par quoi la trypsine est d'abord activée ?
par l'entéropeptidase
58
la trypsine active quoi ?
le trypsinogène, le chymotrypsinogène, la proélastase, et la procarboxypeptidase, etc
59
quels sont les protéases à sérine de type 1 ?
- Chymotrypsinogène
- trypsine
- Élastase
60
quels sont les points à noter de la comparaison des structures primaires de protéases à sérine de type I ?
- moins de 50% de résidus identiques
- les 3 résidus de la triade catalytique sont conservés et occupent les mêmes positions
- plusieurs ponts disulfures, dont certains conservés
61
que montre le repliement de la structure 3D des protéases de la famille S1 ?
une structure à deux domaines, avec le site actif entre les deux domaines
62
qu’est-ce qui consiste les domaines de la famille des protéases S1 ?
chaque domaine consiste en un tonneau beta (brins b antiparallèles), et les deux tonneaux sont orientés à angle droit.
63
les structures tertiaires de la trypsine et de l’élastase sont très similaires à celle
de la chymotrypsine même si leurs séquences ont moins de 50% de résidus
communs. Mais où se situent les différences majeures ?
les différences majeures se situent au niveau des régions exposées et des boucles externes.
64
quels sont les différences de conformation entre le chymotrypsynogène et la chymotrypsine ?
chymotrypsinogène:
- structure maintenue dans un état repliée
- site actif caché par un inhibiteur interne qui bloque l'accès du substrat au site catalytique.
chymotrypsine:
- interaction électrostatique entre le carboxylate de Asp194 et l’amine de Ile16 qui est essentielle à la structure de la chymotrypsine active
- cette interactions entraîne des changements de conformation pour mieux réagir
65
nomme-moi un inhibiteur naturel de protéase de type canonique ?
égline C
66
quels sont les résidus de la triade catalytique ?
1. H57
2. D102
3. S195
67
quel est le rôle de la poche de l'oxyanion dans la chymotrypsine ?
de stabiliser l’oxyanion de l’intermédiaire tétraédrique
68
de quoi est formé la poche de l'oxyanion ?
des atomes des groupes amides de Ser195 et de Gly193
69
c'est quoi une évolution convergente ?
des protéines non apparentées qui ont évolué indépendamment pour acquérir un même mécanisme catalytique (séquences d'acides aminés et des structures tridimensionnelles très différentes, mais leur site catalytique possède une triade de résidus similaires et le mécanisme enzymatique est le même)
70
exemple d'évolution convergente ?
subtilisine avec chymotrypsine
71
c'est quoi une évolution divergente ?
une homologie de séquence et de structure sont partagées, indiquant qu'elles viennent d'un ancêtre commun.
Cependant, bien que le mécanisme catalytique soit conservé, leur spécificité a divergé, ce qui illustre une évolution divergente.
(origine commune, spécialisation différente)
72
à quoi correspond la spécificité d'une enzyme ?
à la propriété de l’enzyme de pouvoir hydrolyser certains substrats de préférence à d’autres
73
quels sont les résidus préférés en P1 chez la chymotrypsine ?
Phe, Tyr, Trp
74
quels sont les résidus préférés en P1 chez la trypsine ?
Lys, Arg
75
quels sont les résidus préférés en P1 chez l'élastase ?
Gly, Ala
76
de quoi dépend la spécificité du substrat ?
en grande partie de la poche de liaison (ou poche de spécificité), qui peut être hydrophobe ou chargée selon l’enzyme
77
quel est le paramètre important à considérer pour déterminer la spécificité d’une enzyme pour un substrat ?
kCat/kM
78
quand [S]>>>Km ya quoi ?
seule KCat détermine la vitesse
79
quand [S]<<< Km ya quoi ?
km/kcat est un indicateur clé de la spécificité enzymatique
80
qu'est ce qu'on utilise pour caractériser la spécificité des protéases ?
- des protéines (chaîne B oxydée de l’insuline)
- des substrats modèles détectables par méthodes spectroscopiques (AA, MCA, PNA)
81
que signifie AA ?
que ce résidu d’Acide Aminé est variable. Un expérimentateur voudra tester différents peptides, chacun avec un acide aminé différent à cette position
82
que signifie MCA ?
7-amino-4-méthylcoumarine, fluoresce lorsque libéré par l’hydrolyse du lien amide AA-MCA.
83
que signifie PNA ?
paranitroanilide, prend une couleur jaune lorsque libérée par l’hydrolyse du lien amide AA-PNA
84
à quoi servent les substrats avec un donneur et un accepteur de fluorescences ?
à quantifier l'activité des protéases
85
quelle est le principe de fluorescence réduite ?
lorsqu'il y a un transfert d'énergie par résonance de fluorescence
l’énergie d’excitation d’un donneur de fluorescence est transférée à un accepteur qui réduit la fluorescence
86
de quoi dépend le transfert d’énergie et la réduction de fluorescence ?
de la distance entre le donneur et l’accepteur
87
quel est le principe de l'augmentation de la fluorescence ?
lorsqu'il y a le clivage d'une liaison peptidique d'un substrat à fluorescence réduite qui sépare le donneur et l'accepteur. Par conséquent, la fluorescence augmente.
88
quelle est la définition de mutagenèse dirigée ?
une induction volontaire d'une ou plusieurs mutations dans un site précis d’un gène recombinant pour produire une protéine muté
89
pourquoi utilise-t-on la mutagenèse dirigée ?
- pour mieux comprendre comment les enzymes fonctionne
- établir les liens entre les paramètres cinétiques
- modifier les propriétés structurales et fonctionnelles des enzymes
90
par quelle équation est exprimée la relation entre l'énergie libre standard de Gibbs de liaison (ΔGS) et la constante de dissociation (KS) ?
l'équation de Van't Hoff
ΔGS= -R T ln Ks
91
à quoi l'efficacité catalytique est ultimement liée ?
à la barrière d'énergie libre
92
pourquoi utilise-t-on le paramètre Kcat/Km ?
1. pour évaluer la contribution d’une interaction à la stabilité de l’état de transition (impliquant des résidus de la triade catalytique et de la poche de l’oxyanion).
2. pour évaluer la contribution d’une interaction à la spécificité de l’enzyme (impliquant les résidus de la poche de spécificité).
93
qu'est-ce qui confère à la Ser195 son caractère nucléophile élevé ?
l'Asp 102
94
