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L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules > Cours 3 > Flashcards

Cours 3 Flashcards

(83 cards)

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1
Q

Sur quel principe est basé la coloration à l’argent?

A

la réduction des ions d’argent

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Q

Quelles sont les étapes de la coloration à l’argent?

A
  • le gel est fixé (immobilise les protéines + enlève les composés qui interfèrent)
  • incubation du gel (fixation de l’Ag avec les protéines et réduction de la fixation du gel) = SENSIBILISATION
  • imprégnation des ions Ag
  • signal de coloration au cuivre par réduction des Ag
  • le développement est arrêté par le bruit de fond
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Q

Sur quel principe est basé la coloration inverse au zinc ?

A

propriétés des protéines qui vont fixer et séquestrer les ions Zn2+ dans un milieu (précipitation imidazole + Zn = Znlm2)

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Q

Quels sont les avantages de la coloration inverse au zinc ?

A

cations métallique pour colorer rapidement les prot, sans fixation, ni colorant orga

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Q

Quels sont les avantages de la coloration aux sondes fluorescentes?

A
  • très sensible

- offre un gamme de réponse linéaire (10 à 100 x plus importante que la colorimétrie)

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6
Q

Quels sont les inconvénients de la coloration aux sondes fluorescentes?

A
  • disposer d’un appareillage adéquat
  • source lumineuse monochromatique
  • filtre (sépare les longueurs d’excitations + émission)
  • syst de détection
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7
Q

Quelles sont les 2 types de sondes ?

A

1- sondes fluorogéniques : intésité du signal augmente par co-localisation avec les protéines
2- sondes intrinsèques fluorescentes : lient sélectivement les prot (et pas le gel)

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8
Q

Comment détecter les modif post-traductionnelles?

A
  • détection par phosphorylation
  • détection par les glycoprotéines
  • détection des O-GlcNAc
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9
Q

Qu’est-ce que la détection des phosphorylations?

A
  • permet de détecter les modif post-trad

- sonde dont une partie se lie au P couplé à un fluorochrome

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10
Q

Qu’est-ce que la détection de glycoprotéines?

A
  • détecte les modif post-trad

- oxydation périodique du glycol + conjugaison hydrazide ( méca de base de Schiff)

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11
Q

Qu’est-ce que la détection des O-GlcNAc ?

A
  • permet la détecttion des modif post-trad

- cyclo addition de Huisgen catalysée par le cuivre entre azide et alkyne

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12
Q

A quoi sert le WesternBlot?

A

suivre la purification de prot sans act enzymatique

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13
Q

Quand le WesterBlot est - il utilisé?

A

premières étapes de la purification

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14
Q

A quoi faut-il faire attention avant de faire une purification (WesternBlot)?

A

coloration des gels par le bleu de Coomassie

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15
Q

Quelles sont les étapes de la révélation du WesternBlot?

A
  • bloquer la membrane avec des prot aspécifique
  • AC primaire + AC sec
  • lavage
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16
Q

A quoi doit-on faire attention pour l’AC secondaire ?

A

doit être couplé à une péroxydase : dégrade le substrat + génère la prod de photon + apparition locale de coloration

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17
Q

Dans quels cas l’électrophorèse 2D est utilisée ?

A

mélanges complexes (lysat cell ou fractions sub cell)

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18
Q

A quoi sert l’électrophorèse?

A
  • séparer plusieurs centaines de prot

- séparer les isoformes d’une prot

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19
Q

Quelles sont les étapes de l’électrophorèse 2D?

A

1- séparation en f° charge

2- séparation en f° du PM

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20
Q

Qu’est-ce que la focalisation isoélectrique (IEF)?

A

méthode de séparation des molé amphotères en f° de leur charge

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21
Q

Comment préparer l’échantillon pour une IEF (focalisation isoélectrique)?

A
  • haute [chaotrope] : urée
  • détergent neutre
  • réducteur de thiol
  • ampholyte porteur
  • absence d’autres ions
  • forte résistance aux champs elec (I faible)
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22
Q

A quoi sert le chaotrope dans la préparation de l’échantillon de IEF (focalisation isoélectrique) ?

A

casser les liaisons H + interactions hydrophobes entre ET au sein des prot

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23
Q

A quoi sert le détergent dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?

A

casser les interactions hydrophobes

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24
Q

A quoi sert le réducteur de thiols dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?

A

casser les ponts disulfures

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25
A quoi sert l'ampholyte porteur dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?
augmenter le pouvoir tampon + force ionique
26
De quoi est composé les tampons amphotères?
Ampholines : mélange d'acides oligo-amino + oligo-carboniques aliphatiques
27
Quel est le gradient de pH pour les tampons amphotères?
compris entre 3 et 10
28
Comment fonctionnent les tampons amphotères?
Les composés acides aliphatiques ont un fort pouvoir tampon + forment un gradient de pH (avec un champ électrique)
29
Comment est crée le gradient de pH immobilisé (IPG)?
groupements acides/basiques copolymérisés avec une matrice polyacrylamide
30
Comment crée un gradient de pH?
moins de 10 dérivés différents
31
Quelles sont les étapes de l'IEF (focalisation isoélectrique)?
``` 1- réhydrater l'IPG (pH immobilisé) 2- positionner le Manifold 3- transférer le IPG vers le Manifold 4- humidifier + assembler les électrodes 5- mettre les échantillons 6- lecture dans l'Etan IPGphor3 ```
32
A quoi sert la DIGE (Difference Gel Electrophoresis)?
- marquer des différents échantillons avec des sondes fluorescentes différentes
33
A quoi servent les sondes fluorescentes ?
détecter + quantifier les prot dans les gels
34
Pourquoi utiliser des sondes fluorescentes pour la DIGE?
- sont aussi sensibles que la coloration à l'Ag | - gamme de réponse linéaire
35
Quelles sont les étapes de la DIGE?
- marquage des échantillons avec différentes sondes fluorescentes - mélanger les échantillons - séparation sur gel 2D - analyse d'image
36
Quelle partie utilise-t-on pour séquencer un peptide?
N-ter
37
Quels sont les 3 réactifs permettant d'identifier la partie N-ter d'un peptide (pour le séquencer)?
- FDNB (Sanger) - Dansyl chloride - Dabsyl chloride
38
Quel est le principe de la dégradation d'Edman
- Polypeptide + Phenylisothio cyanate - Phe s'accroche en N-ter + clivage du peptide (chaine latérale) - détection de Phe en N-ter
39
Quels sont les avantages de la dégradation d'Edman pour la séquençage du N-ter?
- séquençage automatique (sur le sequenator) - tech sensible (qqs pg) - bon rendement > 99% - lecture max 50 aa
40
Quelles sont les étapes de séquençage des polypeptides?
- casser les pont disulfures - coupure chimique ou enzymatique - purification des peptides - séquençage de chaque peptide - mise en ordre
41
Quelles sont les différentes techniques de séquençage des polypeptides?
1- hydrolye et séparation 2- réaction avec le FDNB, hydrolye et séparation 3- casser les ponts disulfures (si présents), séparation, dégradation d'Edman 4- établir la séquence
42
A quoi sert la spectrométrie de masse?
déduire la masse précise d'une molé sous l'influence d'un champ élec ou magnétique (à vide)
43
Quelles sont les 2 méthodes de spectrométrie de masse?
- MALDI MS | - ESI MS
44
A quoi sert l'EMI MS?
- spectro de masse - donne un nbr varaible de protons - affiche des pics avec un incrément de charge de 1 et de masse 1 (1 proton)
45
Quelles sont les étapes de la MS en tandem (spectro de masse)?
- isolement d'un type de peptide par une MS - sélection + fractionnement des peptides (1 coupure/pept) - un des deux peptides possède une charge qui sera détectée
46
De quoi est composé le lot de pics des spectres MS/MS?
de tous les fragments chargés produits par la cassure du même type de liaison + même côté
47
Que représente chaque pic dans les spectres MS/MS?
1 aa de moins que le pic précédent
48
Comment identifier l'aa perdu entre chaque pic du spectre MS/MS?
différence de masse entre les peptides (prb : Leu et Ile)
49
Qu'est-ce qu'une enzyme?
- participe à une réaction chimique en augmentant - augmente la vitesse - n'apparait pas dans les produits
50
qu'est-ce que la constante de proportionnalité (k+2)?
étapes de ES à P | pseudo ordre 1
51
A quoi correspond le kcat?
nombre de turnover = nbr max de molé de S converties en P/site actif/tps
52
Qu'est-ce que l'état quasi-stationnaire? Que permet-elle de calculer?
- vitesse de réaction est cst - [ES] ne varie pas - constante Michealis-Menten (Km)
53
Comment mesurer l'AS d'une réaction enzymatique?
test basé sur la capacité à faire la distinction entre les prop. physicochimiques du S et du P (de manière quantifiable)
54
Quels tests effectuons nous pour mesurer l'activité d'une enzyme?
- test continu - test continu couplé - test discontinu - test radiométrique
55
En quoi consiste un test continu?
- capacité à mesurer en continu la disparition d'un S ou l'apparition d'un P - basé sur de la spectro (absorption UV ou émission de fluorescence)
56
En quoi consiste le test continu couplé?
Quand le S n'a pas de prop spectro, il faut ajouter des E en plus pour coupler = prop spectro (ex: NADH)
57
En quoi consiste le test discontinu?
- le réaction E est stoppée manuellement - séparation de S (95%) - quantification par intervalle de temps (radiométrique)
58
En quoi consiste le test radiométrique?
- noyau instable de radio-isotope subit une décroissance pour former un isotope stable = béta-émission - comptage à scintillation d'émission des béta particules = détermine la radioA (cpm)
59
Qu'est-ce que les endonucléases de restrictions?
- coupent l'ADN viral en laissant intégre l'ADN bactérien protégé par des méthylations - découvertes par Werner Arber 1960 - sont synthétisées à partir de bactéries - 3 types d'endonucléases
60
Qu'est-ce que les endonucléases de type 1?
- coupent l'ADN à des sites aléatoires qui p e éloignés de 1000 pdb du site de reconnaissance - complexes SU (modification + restriction) - ATP dép
61
Qu'est-ce que les endonucléases de type 3?
- coupent l'ADN à environ 25 pdb du site de reconnaissance - complexes SU (modification + restriction) - ATP dép
62
Qu'est-ce que les endocnucléases de type 2 (ER)?
- en 1970 Par Smith - PAS ATP dép - coupent l'ADN dans le site de reconnaissance lui-même - les séq reconnues ont une taille de 4 à 6 pdb (palindromiques)
63
Quelles types d'extrémités les endonucléases de type 2 peuvent générer après coupure de l'ADN?
- franches : EcoRV - cohésives 5' sortantes : BamHI - cohésives 3' sortantes : PstI => extrémité toujours 3' OH/5' PO4-
64
Qu'est-ce isoschizomères?
ER d'origines différentes qui coupent tout ou une partie de la même séq
65
Qu'est-ce que les ER compatibles?
ER libérant des extrémités cohésives complémentaires à un autre site de restriction
66
Qu'est-ce que l'unité ER?
quantité d'ER capable de couper 1 µg de phage à tous les sites de coupure en 1h dans des conditions optimales
67
Quels sont les différents tampns des ER?
- NEBuffer 1.1 - NEBuffer 2.1 - NEBugger 3.1 - CutSmart
68
Qu'est-ce que l'activité aspécifique des ER?
- couper l'ADN à des sites similaires à leur sites de restrictions dans des conditions non standard = activité star - ex syst de méthylation de E.Coli (Dam/Dcm et EcoKI)
69
Qu'est-ce que les ADN ligases?
- catalysent la formation d'une liaison phosphodiester entre l'extrémité 3'OH et 5'P adajcente - ATP dép - Ligase + connue : T4
70
De quoi dépend l'efficacité des ADN ligases?
- concentration en ADN - ration entre plasmide et insert (pdb) - clonage - nature des extrémités
71
A quoi sert la phosphatase?
- déphosphoryler le 5' P - ADN ligases ne peuvent pas agir = pas de ligation = pas de circularisation - + connue : CIAP
72
A quoi sert l'ADN pol thermostable?
- PCR (taq pol) - PCR sur colonnie - marquages sondes de PCR - clonages par PCR
73
Qu'est-ce qu'un vecteur de clonage ?
ADN extra-chromosomique de petite taille, rentrant dans la C, et possède sa propre origine de réplication
74
Quelles sont les caractéristiques des vecteurs de clonage?
- ORI - MCS (avec sites de restrictions uniques) - marqueurs de sélection (gène de résistance) - marqueur de clonage Ex: pBR (plasmid Boliver et Rodriguez)
75
Qu'est-ce que les vecteurs d'expression?
- possèdent séq pour réguler la transcription et la trad - promoteur de trans - séquence de term - opérateur (régulation) - site de fixation du ribosome
76
Qu'est-ce que la PCR?
- réaction de polymérisation en chaine | - 3 étapes
77
Quelles sont les étapes de la PCR?
- dénaturation 95° - amplification 60°: dénaturation+hybridation+extension - polymérisation 70°
78
A quoi correspondent les banques d'ADNc?
- séquençage d'ADNc de gènes de protéines d'un grand nbr d'orga - clones conservés dans des banques
79
Quelles sont les étapes de clonage?
- gène amplifié par PCR - produit PCR cloné dans un vecteur - vérification par séquençage - gène sous cloné dans plusieurs vecteurs d'expression
80
Quelles sont les stratégies de clonage?
- ER - TA-clonage - TOPO cloning - LIC (Ligation) - recombinaison
81
Comment choisir les amorces pour une PCR?
- séquence 3' critique - longueur de 18 à 30 pdb - T° de fusion > 60° - contenu en GC entre 40 et 60%
82
Quelles sont les caractéristiques des polymérases pour un réaction de PCR?
- stabilité thermique pour la dénaturation = pas de perte d'activité - taux d'extension : vitesse d'extension à 4kb/min - fidélité : la fréquence de nt incorrect incorporé - processivité : probabilité que la pol se détache
83
Comment faire un clonage par des ER?
- préparation du vecteur (digestion et desphophorylation + purification du vecteur) - préparation de l'insert (digestion avec 2 ER différentes et purification de l'insert) - ligation (ADN ligase T4)

L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules (8 decks)

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