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L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules > Cours 2 > Flashcards

Cours 2 Flashcards

(60 cards)

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1
Q

Quelles sont les techniques permettant de concentrer les protéines?

A
  • chromatographie
  • electrophorèse
  • dialyse
  • ultrafiltration
  • lyophilisation
  • précipitation
  • cristallisation
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Q

Citer les 3 chromatographies

A
  • filtration sur gel (SEC)
  • échangeuse d’ions (IEX)
  • en phase réverse (RP)
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Q

En quoi consiste la chromatographie de filtration sur gel?

A
  • exclusion des macromolécules par un gel de polyacrylamide

- colonne Zeba à centrifuger

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4
Q

En quoi consiste la chromatographie échangeuse d’ions (IEX)?

A

résine échangeuse d’ions mixte, permet de capturer les anions et cations non organiques

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Q

Quel problème rencontre-t-on lorsqu’on fait une chromatographie échangeuse d’ions?

A

risque d’acidification et précipitation des protéines

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6
Q

En quoi consiste la chromatographie en phase réverse (RP)?

A
  • permet la séparation, dessalage et concentration des protéines
  • utilisation d’un solvant volatile
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7
Q

A quoi sert la chromatographie en phase réverse ?

A

préparer les échantillons de spectroscopie de masse

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8
Q

Quel est le risque de la chromatographie en phase réverse?

A

protéines souvent dénaturées

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9
Q

Qu’est-ce qu’une dialyse?

A
  • méthode de séparation en fonction de la taille

- transfert de masses diffusifs par différence de concentration à travers une membrane semi-perméable

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10
Q

A quoi sert une dialyse?

A
  • enlever les solutés de faible poids d’une solution protéique
  • echanger la solution protéique avec le moins de perturbations possibles
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11
Q

En quoi consiste une dialyse?

A

2 compartiments séparés par une membranes semi-perméable. Les macromolécules ne peuvent pas passer, seules les molécules solubles le peuvent.

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12
Q

Citer les facteurs affectant la dialyse

A
  • volume de l’échantillon
  • taille des pores (MWCO)
  • type de membrane
  • température
  • viscosité
  • taille de la molécule
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13
Q

Quelles sont les conditions de la dialyse?

A
  • petit volume d’échantillon pour un grand volume de solution
  • basse température (4°) pour préserver la protéine
  • renouvellement de l’échantillon
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14
Q

Qu’est-ce que l’ultrafiltration (UF)?

A
  • ne laisse pas passer les ions et les petits molécules via une membrane semi-perméable
  • transfert de masse par différence de pression
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15
Q

Comment doivent-être les membranes d’ultrafiltration?

A

résistante à la pression et perméable

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16
Q

Qu’est-ce que la diafiltration?

A

échange de tampon par ultrafiltration

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17
Q

Citer les 2 méthodes de diafiltration

A
  • continue (V constant)

- discontinue (centrifugation puis ajout de solutions)

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18
Q

Qu’est-ce que la lyophilisation?

A

concentration des protéines par évaporation ou en faisant bouillir

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19
Q

Comment faire pour arriver au point d’ébullition sans dénaturer la protéine? et dans quelle méthode utilise-t-on l’ébullition?

A
  • lyophilisation

- concentration sous vide, il faut diminuer la pression

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20
Q

Donner les étapes de la lyophilisation

A
  • congélation : stabilisation des protéines (attention aux cristaux de glace)
  • déssication primaire (80% du solvant est sublimé)
  • déssication secondaire (enleve le solvant)
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21
Q

En quoi consiste la précipitation?

A
  • séparer une protéine d’une solution en la faisant passer à l’état solide par modification de sa solubilité
  • le précipité est séparer par centrifugation
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22
Q

Comment induire la précipitation?

A

addition de sels, solvants organiques, ions métallique, acides/bases, polymères hydrophobes

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23
Q

Pourquoi la technique de précipitation pour concentrer les protéines n’est pas beaucoup utilisée?

A

altère souvent les protéines

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24
Q

Quels sont les précipités les plus courant?

A
  • éthanol
  • acétone
  • chloroforme
  • méthanol
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25
Quelle méthode utilise-t-on pour ne pas altérer les protéines lors d'une précipitation
précipitation non dénaturante par du PEG (polymère hydrophile) et des sels neutres
26
En quoi consiste la cristallisation?
- concentre, purifie et stabilise la protéine | - molécules hautement ordonnées dans des cristaux
27
Pourquoi n'utilise-t-on pas souvent la cristallisation?
cristallisation est plus difficile à obtenir que la précipitation
28
Donner les étapes de cristallisation
dite "goutte en suspension". Une goutte de protéine est placée au dessus du réservoir. Le réservoir étant plus concentrer, il y aura une diffusion de la goutte vers le réservoir
29
Comment quantifier les protéines?
- Loi de Beer-Lambert - spectro absorption UV - specrto absorption visible
30
A quelle longueur d'onde absorbee les ADN?
260nm
31
A quoi doit-on faire attention lorsqu'on purifie les AN?
l'échantillon doit être pur. | EDTA et phénol absorbent au aussi à 260nm
32
A quoi sert de mesurer la quantité de protéines?
de calculer les rendements et activité spécifique
33
Quelle loi utilise-t-on si on a un mélange protéique?
Warbung et Christian
34
Que donne le rapport des DO?
l'indice de pureté
35
Pourquoi faisons-nous une spectro à 205nm pour les protéines, alors qu'elles absorbent à 280nm?
pour éviter les interférences des solvants et les composants biologiques
36
Définir le coefficient d'extinction
somme de toutes les espèces qui absorbent des photons dans une molécule
37
Citer les 3 méthodes de colorimétries
- test de Bradford - test de Lowry - test BCA
38
En quoi consiste le test de bradford?
- bleu de coomassie - pH acide - résidus aromatiques
39
Donner les avantages et inconvénients du test de bradford
- facile - sensible - bon marché - mauvais pour les petites protéine - gamme linéaire - perturbé par les détergents
40
En quoi consiste le test de Lowry?
2étapes : - réduction de Biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines - amplification du signal par la réduction de Folin-Ciocalteu - coloration bleu (7550nm)
41
Donner les avantages et les inconvénients du test de Lowry
- sensible aux détergents - plage dynamique - rapide - stable
42
En quoi consiste le test de BCA?
dérivé du test de Lowry: - réaction de biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines - amplification du signal par la réduction par l'acide bicinchoninique (BCA) - couleur pourpre
43
Donner les avantages et les inconvénients du test de BCA
- améliore la sensibilisation du test - tolérance aux agents interférants - sensible aux agents chélatants du cuivre - sensible à la température
44
Donner les étapes de l'électrophorèse
- séparation d'ADN ou ARN en fonction de la taille - matrice de séparation inerte ou gel - champ électrique (+ la molécule est grande, moins elle migre) - colorants pour réveler - échelle pour analyser la tailles
45
Définir l'électrophorèse
décrit la migration d'une particule chargée sous l'influence d'un champ électrique
46
Citer 2 gels utilisés pour séparer les AN en électrophorèse
- gel d'agarose - gel polyacrylamide (PAGE) car les ADN ont des charges négatives
47
Citer 2 tampons d'électrophorèse
- TAE : bonne résolution, mais capacité vite épuisée | - TBE : bonne résolution, grande capacité
48
Comment révéler les AN lors d'une électrophorèse?
- bromure d'éthidium: intercalant | - ADN révélé dans les UV
49
Citer les autres méthodes de coloration des gels d'électrophorèse
- SYBR gold - bleu de méthylène - cuivre - coloration à l'argent
50
Quelle molécule est principalement séparée en électrophorèse PAGE?
ARN
51
Donner les avantages du PAGE par rapport aux autres électrophorèses
- meilleure résolution | - visualisation des conditions natives (AN/protéines)
52
Donner les avantages et les inconvénients de l'électrophorèse PAGE dite "en conditions natives"
- peut pas distinguer la taille, la forme et la mobilité - peut pas estimer la pureté ou le PM - on peut séparer et catégoriser les échantillons
53
Définir le SDS-PAGE et que met-il en évidence?
- Dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) - permet d'identifier et suivre les protéines lors des étapes de purification - détermine la composition et le PM
54
Donner les étapes du SDS-PAGE
- protéines traitées au SDS chaud : casse les liaisons non covalentes + linéarise les les molécules - agent réducteur des ponts disulfures : sépare les SU - migration : donne la masse
55
Définir le SDS-PAGE par Leammli (1970)
système discontinu de 2 gels: - gel de séparation - gel d'empilage
56
A quoi sert la différence de tampons et de gels utilisés lors d'une électrophorèse SDS-PAGE de Laemmli ?
- gels différents en porosité, pH, force ionique | - tampons permet de concentrer les échantillons dans le 1er gel et les séparer dans le 2e
57
Donner les 4 composants du système discontinu du SDS-PAGE de Laemmli (du haut vers le bas)
- tampon de migration - tampon de l'échantillon - gel de concentration - gel de séparation
58
Donner les techniques de révélations non spécifiques et spécifiques des électrophorèses SDS-PAGE
- non spécifiques : bleu de coomassie, à l'argent, au cuivre | - spécifiques : Western blot
59
Donner les étapes générales de coloration des gels?
- gel est fixé : immobilisation des protéines - gel est coloré - la coloration est stoppée ou décoloré pour réduire le bruit de fond
60
Définir le bleu de Coomassie
- triméthyléthane disulfonés (CBB R-250) | - interactions électrostatiques avec des aa basiques protonés (lys, arg, his) + résidus hydrophobes aromatique

L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules (8 decks)

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