Cours 3 - Expression et purification des protéines Flashcards
(166 cards)
1
Q
Quels sont les facteurs importants à considérer pour l’expression et la purification des protéines ? (3)
A
→ La source de la protéine,
→ La pureté et la quantité nécessaire,
→ Ainsi que les types d’expériences.
2
Q
Quels sont les quatre types d’applications pour l’expression et la purification des protéines ?
A
→ Études d’activité,
→ Études de structure,
→ Application industrielle,
→ Application thérapeutique.
3
Q
Quelle est la quantité et la pureté requises pour les études d’activité des protéines ?
A
→ Les études d’activité nécessitent des quantités allant de µg à mg avec une pureté de 80-90%.
4
Q
Quelle est la quantité et la pureté requises pour les études de structure des protéines ?
A
→ Les études de structure nécessitent 1 à 25 mg de protéines avec une pureté d’au moins 95%.
5
Q
Quelle est la quantité et la pureté requises pour les applications industrielles des protéines ?
A
→ Les applications industrielles nécessitent des quantités en kg, mais la pureté est variable selon l’usage.
6
Q
Quelle est la quantité et la pureté requises pour les applications thérapeutiques des protéines ?
A
→ Les applications thérapeutiques nécessitent des quantités en kg avec une pureté de plus de 99%.
7
Q
Quels sont les quatre principaux compartiments cellulaires où une protéine peut être localisée ?
A
→ Membrane,
→ Noyau,
→ Cytoplasme,
→ Réticulum endoplasmique.
8
Q
Quels sont les principaux paramètres physico-chimiques d’une protéine à considérer pour sa purification ? (4)
A
→ Taille moléculaire,
→ Point isoélectrique,
→ Modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, méthylation, etc.),
→ Liaison avec métal ou ligand.
9
Q
Quelle technique est utilisée pour purifier une protéine en fonction de sa taille moléculaire ?
A
→ La filtration sur gel.
10
Q
Comment le point isoélectrique influence-t-il la purification des protéines ?
A
→ Il permet la purification par échange d’ions.
11
Q
Quelles sont les cinq principales sources de protéines?
A
→ Tissus animaux,
→ Bactéries,
→ Levures,
→ Cellules d’insectes,
→ Cellules humaines.
12
Q
Pourquoi l’utilisation des tissus animaux comme source de protéines est-elle limitée ?
A
→ À cause de l’absence de surexpression, ce qui réduit la quantité de protéines produites.
13
Q
Quels sont les avantages des systèmes cellulaires en termes de production de protéines ?
A
→ Augmentation de la masse cellulaire et augmentation de la masse de protéines extraites.
14
Q
Quelles sont les principales étapes de l’isolation de protéines à partir de tissus animaux ?
A
→ Localiser une source,
→ Prélever l’organe optimal,
→ Homogénéiser les tissus,
→ Purifier la protéine.
15
Q
Pourquoi la localisation de la source est-elle une étape clé dans l’isolation des protéines ?
A
→ Parce que la présence de la protéine d’intérêt peut être aléatoire ou spécifique à un organe.
16
Q
Quels sont les trois principaux avantages de l’isolation de protéines à partir de tissus animaux ?
A
→ La protéine est native,
→ Elle possède des modifications post-traductionnelles,
→ La méthode est peu coûteuse.
17
Q
Quelles sont les principales limites de l’isolation des protéines à partir de tissus animaux ? (3)
A
→ Les sources sont limitées,
→ La quantité de protéines spécifiques est faible
→ Il n’y a pas d’étiquette (tag) pour faciliter la purification.
18
Q
Quelles sont les principales étapes du processus d’expression de protéines dans les bactéries ? (4)
A
→ Construction du vecteur,
→Sélection avec antibiotique,
→ Culture et induction de la protéine,
→ Purification et analyse.
19
Q
Quel est le rôle de l’IPTG dans l’induction de la protéine ?
A
→ Il mime le lactose et active le promoteur du gène, entraînant l’expression de la protéine.
→ Parce qu’il est plus stable que le lactose et ne peut pas être métabolisé par la bactérie.
20
Q
Quels sont les principaux avantages de l’expression de protéines dans les bactéries ? (4)
A
→ Production élevée de protéines,
→ Coût faible des milieux, culture et expression rapides,
→ Disponibilité de nombreux vecteurs d’expression (tag / étiquettes)
→ Facilité d’expression de protéines marquées (RMN et rayons-X) avec des souches bactériennes auxotrophes.
21
Q
Pourquoi les souches bactériennes auxotrophes sont-elles utilisées pour l’expression de protéines marquées ?
A
→ Ces bactéries ne peuvent pas synthétiser certains composés essentiels et doivent les obtenir de leur milieu, ce qui permet d’incorporer des isotopes spécifiques (ex. glucose-C13, sel ammonium-N15) pour les analyses RMN et rayons-X.
22
Q
Quelles sont les principales limites de l’expression de protéines dans les bactéries ?
A
→ Absence de modifications post-traductionnelles et de ponts disulfures,
→ Inefficacité pour les protéines membranaires,
→ Différences de codons entre la bactérie (problème de codons rares)
23
Q
Pourquoi les codons rares posent-ils un problème pour l’expression de protéines humaines dans les bactéries ?
A
→ Parce que la fréquence d’utilisation des codons est différente entre les bactéries et les cellules humaines,
→ Ce qui peut entraîner une mauvaise traduction et un faible rendement en protéines.
24
Q
Quels sont trois exemples de codons rares chez les bactéries (3)?
A
→ Pro- ARNt
→ Arg- ARNt
→ Leu- ARNt
25
Quelles sont les deux principales stratégies pour résoudre le problème des codons rares en bactérie ?
1) Synthèse de gènes optimisés pour les bactéries (optimisation des codons).
2) Utilisation de bactéries exprimant des ARNt supplémentaires pour les codons rares. Cellules Rosetta 2
26
Quelles sont les principales étapes du processus d’expression de protéines dans la levure ?
→ Construction du vecteur,
→ Sélection avec un acide aminé (P. pastoris),
→ Culture et induction avec MeOH,
→ Purification et analyse.
27
Quel organisme est mentionné pour l’expression de protéines dans la levure ?
→ Pichia pastoris.
28
Quelle méthode de sélection est utilisée dans l’expression de protéines en levure ?
→ La sélection avec un acide aminé.
29
Quel est le rôle du méthanol dans l’induction de l’expression des protéines en levure ?
→ Il active le promoteur de l’alcool oxydase (AOX), qui contrôle l’expression du gène d’intérêt.
30
Quels sont les principaux avantages de l’expression de protéines dans la levure ? (3)
→ Production élevée de protéines, coût faible des milieux,
→ Formation de ponts disulfures et de certaines modifications post-traductionnelles,
→ Expression de protéines marquée est possible (RMN).
31
Quelle modification post-traductionnelle est spécifiquement mentionnée comme étant possible en levure ?
→ La phosphorylation.
32
Quelles sont les principales limites de l’expression de protéines dans la levure ? (3)
→ Croissance plus lente que les bactéries (3-5 jours),
→ Différences de codons,
→ Inefficacité pour les protéines glycosylées.
33
Quelles sont les principales étapes du processus d’expression de protéines chez l’insecte ? (4)
→ Construction de vecteurs (bactérie),
→ Identification et amplification du baculovirus,
→ Culture et infection de cellules Sf9,
→ Purification et analyse.
34
Comment l’infection des cellules d’insecte influence-t-elle la production de protéines ?
Plus l'infection est forte = plus la protéine produite.
35
Quels sont les principaux avantages de l’expression de protéines chez l’insecte ?
→ Ponts disulfures et modifications post-traductionnelles.
→ Très bon pour les protéines glycosylées.
→ Utilisation de vecteurs avec His-tag et GST-tag
→ Meilleures codons- bon pour les grosses protéines humaines.
36
Quels tags sont couramment utilisés pour faciliter la purification des protéines en système insecte ?
→ His-tag et GST-tag.
37
Quels sont les principaux inconvénients de l’expression de protéines en système insecte ? (3)
→ Pas rapide (1-2 semaines) et moins de protéine
→ Milieux spéciaux (Plus chers)
→ La production de protéines marquées est difficile
38
Quel est l’intérêt d’utiliser des vecteurs avec His-tag et GST-tag dans l’expression des protéines chez l’insecte ?
→ Les vecteurs avec His-tag et GST-tag facilitent la purification des protéines par chromatographie d'affinité.
39
Quelles sont les principales étapes du processus d’expression de protéines dans les cellules humaines ? (4)
→ Construction du vecteur (pTT),
→ Production du vecteur en bactérie,
→ Culture et transfection des cellules HEK293,
→ Purification et analyse.
40
Quel type de vecteur est utilisé pour l’expression dans les cellules humaines ?
→ Le vecteur pTT.
41
Quelle lignée cellulaire humaine est mentionnée pour l’expression de protéines ?
→ Les cellules HEK293.
42
Quelles sont les deux principales formes d’expression possibles avec le vecteur pTT ?
→ Expression intracellulaire et sécrétion extracellulaire.
43
Pourquoi le vecteur pTT est-il préféré par rapport au vecteur pCDNA ?
→ Il est jusqu’à 10 fois plus efficace que pCDNA.
44
Quelle est la quantité de protéine recombinante pouvant être produite avec le vecteur pTT ?
→ Entre 20 et 60 mg par litre.
45
Quel type d’étiquette est utilisé pour faciliter la purification des protéines produites avec le vecteur pTT ?
→ His-TAG.
46
Pourquoi les cellules HEK293-E6 sont-elles adaptées à l’expression de protéines humaines ?
→ Elles n’ont aucun problème de codon rare, ce qui permet une traduction efficace des protéines humaines.
47
Quel rôle joue la surexpression des chaperons dans les cellules HEK293-E6 ?
→ Elle permet un repliement optimal des protéines, réduisant ainsi les risques d’agrégation.
48
Pourquoi la croissance en suspension est-elle un avantage pour les cellules HEK293-E6 ?
→ Possibilité de densité cellulaire plus élevée
49
Quels sont les principaux avantages de l’expression de protéines dans les cellules humaines ?
→ Ponts disulfures, modifications post-traductionnelles et protéines membranaires
→ Les protéines contaminantes ne sont pas immunogènes
→ Vecteurs production avec His-tag
→ Codons parfaits- meilleur choix pour les très grosses protéines humaines
50
Quels sont les principaux inconvénients de l’expression en cellules humaines ?
→ Pas rapide (1-2 semaines) et moins de protéine
→ Besoin d’un fermenteur pour grosse production
→ Milieux spéciaux (Plus cher)
→ La production de protéines marquées est impossible
51
Pourquoi la production de protéines marquées est-elle difficile en cellules humaines ?
→ Parce que les cellules humaines ne peuvent pas facilement incorporer des isotopes spécifiques, rendant difficile leur utilisation en RMN ou en cristallographie.
52
Quel système est recommandé pour l’expression des petites protéines ou domaines sans ponts disulfures ?
→ Les bactéries, et en cas d’échec, l’optimisation des codons ou le passage aux cellules Sf9 ou HEK293.
53
Que faire si une petite protéine ou un domaine avec ponts disulfures ne s’exprime pas en levure ?
→ Optimiser les codons ou utiliser les cellules Sf9 ou HEK293.
54
Quels systèmes sont les plus adaptés pour l’expression des protéines membranaires ?
→ Sf9 (cellules d’insecte) ou HEK293 (cellules humaines).
55
Quels systèmes sont recommandés pour l’expression des grosses protéines humaines ?
→ Sf9 ou HEK293.
56
Quels systèmes sont préférés pour l’expression de protéines marquées pour la RMN ou la cristallographie aux rayons X ?
→ Les bactéries (E. coli) pour la RMN ou la cristallographie aux rayons X, et la levure pour la RMN.
57
Quel est le système d’expression recommandé pour les applications thérapeutiques ?
→ Les cellules humaines HEK293.
58
Pourquoi HEK293 est-il préféré pour les applications thérapeutiques ?
→ Parce qu’il permet l’expression de protéines avec des modifications post-traductionnelles humaines et une compatibilité immunologique optimale.
59
Quelle est la première étape du processus de purification des protéines ?
→ Suspendre et lyser les cellules.
60
Quel paramètre est mentionné pour le tampon de lyse ?
→ Un pH physiologique de 7,4.
61
Quelle est la centrifugation initiale utilisée après la lyse des cellules ?
→ Une centrifugation à basse vitesse (LSS) de 20 000 x g pendant 30 minutes.
62
Quels sont les deux produits obtenus après cette première centrifugation ?
→ Le surnageant et le culot.
63
Que contient le surnageant après la centrifugation ?
→ Les protéines solubles.
64
Quelle est l’étape suivante pour purifier les protéines solubles ?
→ Une centrifugation à haute vitesse (HSS) de 100 000 x g pendant 1 heure.
65
Pourquoi la purification des protéines solubles est-elle illimitée ?
→ Parce qu’elles restent en solution et peuvent être facilement traitées avec différentes méthodes de purification.
66
Que contient le culot après la première centrifugation ?
→ Les corps d’inclusion, qui sont souvent des protéines mal repliées dues à la surexpression.
67
Comment sont solubilisées les protéines des corps d’inclusion ?
→ Avec des agents chaotropiques comme l’urée et le guanidium.
68
Quelles sont les trois grandes étapes de la purification des protéines solubles ?
→ Capturer (isoler et concentrer),
→ Purifier (retirer les grosses impuretés),
→ Polir (retirer les petites impuretés).
69
Quels sont les trois types de techniques utilisées pour capturer une protéine et la concentrer ?
→ Précipitation saline,
→ Chromatographie d’affinité,
→ Chromatographie par échange d’ions.
70
Quels sont les deux types de chromatographie utilisés pour purifier la protéine et éliminer les grosses impuretés ?
→ Chromatographie d'affinité
→ Chromatographie par échange d'ions.
71
Quels sont les deux types de chromatographie utilisés pour la dernière phase de purification ?
→ Chromatographie par filtration sur gel
→ Chromatographie en phase inverse.
72
Quels agents chaotropiques sont utilisés pour solubiliser les corps d’inclusion ?
→ L’urée (8M) et le guanidinium (6M).
73
Quels sont les deux types de chromatographie utilisés pour la purification des protéines en urée ?
→ Chromatographie par échange d’ions,
→ Chromatographie d’affinité (His-tag),
→ Chromatographie par filtration sur gel.
74
Quels sont les types de chromatographie utilisés pour la purification des protéines en guanidinium ?
→ Chromatographie d’affinité (His-tag),
→ Chromatographie par filtration sur gel.
75
Quelle est la différence entre la purification en urée et celle en guanidinium ?
→ La purification en urée inclut une étape supplémentaire de chromatographie par échange d’ions.
76
Après la purification, quelle est l’étape essentielle pour récupérer une protéine fonctionnelle ?
→ La renaturation avec un tampon physiologique.
77
Quelle est la dernière étape après la renaturation ?
→ Les essais biologiques pour tester l’activité de la protéine.
78
Quel est l’intervalle de pH recommandé pour la stabilité des protéines en purification ?
→ 6,0 - 9,0.
79
Quels sont les trois tampons couramment utilisés pour la purification des protéines ?
→ Tris-HCl,
→ Phosphate,
→ HEPES.
80
Quels sels sont utilisés pour stabiliser les protéines en solution ?
→ NaCl et KCl.
81
Pourquoi ajoute-t-on des sels comme NaCl ou KCl lors de la purification des protéines ?
→ Pour maintenir la stabilité des protéines en réduisant les interactions non spécifiques et les précipitations.
82
Quels sont les deux agents dénaturants utilisés pour la solubilisation des protéines ?
→ Urée et guanidinium.
83
Quel type de mélange est généralement utilisé pour inhiber les protéases ?
→ Un mélange de plusieurs inhibiteurs pour couvrir un large spectre d’activités protéolytiques.
84
Quels sont les deux principaux agents réducteurs utilisés comme antioxydants ?
→ DTT (dithiothréitol) et BME (β-mercaptoéthanol).
85
Pourquoi les antioxydants comme le DTT et le BME sont-ils importants pour certaines protéines ?
→ Ils empêchent la formation de ponts disulfures indésirables en réduisant les résidus cystéine.
86
Quels sont les trois niveaux de purification d’une protéine précipitée saline ?
→ Première étape : Capturer – isoler et concentrer la protéine.
→ Deuxième étape : Purifier – retirer les grosses impuretés.
→ Troisième étape : Polir – éliminer les petites impuretés.
87
Pourquoi cette méthode ne nécessite-t-elle pas d’équipement chromatographique ?
→ Parce qu’elle repose sur une précipitation chimique plutôt que sur une séparation basée sur l’interaction avec des supports chromatographiques.
88
Pourquoi la précipitation saline est-elle considérée comme une méthode semi-sélective ?
→ Parce qu’elle permet d’enrichir une protéine d’intérêt en réduisant la quantité d’impuretés,
→ Mais sans offrir une séparation fine comme la chromatographie.
89
Dans quels types d’échantillons la précipitation saline est-elle généralement utilisée ?
→ Dans les extraits de tissus animaux.
90
Pourquoi cette méthode (saline) ne fonctionne-t-elle qu’avec des protéines solubles ?
→ Parce que les protéines dans des corps d’inclusion ne peuvent pas être précipitées efficacement et nécessitent une solubilisation préalable avec des agents chaotropiques.
91
Pourquoi commence-t-on avec la fraction soluble dans la précipitation saline des protéines ?
→ Parce que seules les protéines solubles peuvent être précipitées efficacement, tandis que les protéines des corps d’inclusion nécessitent une solubilisation avec des agents chaotropiques.
92
Quel est l’agent utilisé pour précipiter les protéines dans la précipitation saline des protéines ?
→ Le sulfate d’ammonium.
93
Pourquoi augmente-t-on progressivement la concentration de sulfate d’ammonium ?
→ Pour précipiter sélectivement les protéines en fonction de leur solubilité.
→ Par incréments de 10 % à la fois
94
Quelle est la concentration finale typique de sulfate d’ammonium utilisée pour précipiter les protéines ?
→ Entre 80 % et 90 %.
95
Pourquoi effectue-t-on une centrifugation après chaque ajout de sulfate d’ammonium ?
→ Pour récupérer les protéines précipitées sous forme de culot.
96
Que fait-on avec les culots identifiés comme contenant la protéine cible dans la précipitation saline des protéines ?
→ Ils sont resuspendus dans le tampon original pour une purification additionnelle.
97
Quel est l’effet de l’ajout de sels comme le sulfate d’ammonium sur la solubilité des protéines ?
→ Il diminue la solubilité des protéines, favorisant leur précipitation.
98
Pourquoi l’augmentation de la concentration en sel favorise-t-elle la précipitation des protéines ?
→ Parce que les sels attirent les molécules d’eau, réduisant ainsi l’hydratation des protéines et augmentant les interactions hydrophobes entre elles.
99
Quels sont les trois types de régions présentes sur la surface d’une protéine ?
→ Régions hydrophobiques,
→ Régions acides (charge négative),
→ Régions basiques (charge positive).
100
Quelle est la principale différence de pression entre FPLC et HPLC ?
→ FPLC fonctionne à une pression moyenne (1500-3000 psi).
→ HPLC fonctionne à une pression élevée (jusqu’à 6000 psi).
101
Quels types de colonnes sont utilisés pour chaque technique (HPLC vs FPLC) ?
→ FPLC : Tubes en PEEK (polymère résistant).
→ HPLC : Tubes en acier ou titane.
102
Quelle est la principale différence entre une élution linéaire et une élution par gradient ?
→ L’élution linéaire utilise un seul tampon,
→ Tandis que l’élution par gradient utilise au moins deux tampons avec une variation progressive de la concentration.
103
Quels sont les principaux caractéristiques de l’élution linéaire ? (3)
→ Protocole plus simple.
→ Équipement moins coûteux.
→ La séparation est moins efficace
104
Quels sont les principaux caractéristiques de l'élution par gradients? (3)
→ Le protocole est plus compliqué
→ L’équipement est plus cher
→ La séparation est plus efficace
105
Quel est le principe de la loi de Beer-Lambert ?
→ Elle relie l’absorbance d’une substance à sa concentration et à sa capacité d’absorption de la lumière à une longueur d’onde donnée.
106
Quelle est la formule de la loi de Beer-Lambert ?
→ A=εlC
107
Quels types de groupes fonctionnels absorbent dans l’ultraviolet en dessous de 250 nm ?
→ Le groupe amide et certains groupes fonctionnels des chaînes latérales des acides aminés.
108
Quels acides aminés absorbent principalement au-dessus de 250 nm ?
→ Les acides aminés aromatiques : phénylalanine, tyrosine et tryptophane.
109
Pourquoi mesure-t-on l’absorption des protéines à différentes longueurs d’onde ?
→ Chaque longueur d’onde cible un type spécifique de liaison ou de structure chimique.
110
Quelle est la longueur d’onde la plus sensible pour détecter les protéines ?
→ 214 nm ou 228 nm, car elles détectent le lien amide de tous les acides aminés.
111
Pourquoi la détection à 254 nm est-elle moins sensible ?
→ Parce qu’elle détecte uniquement le noyau aromatique de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane.
112
Quelle est la longueur d’onde spécifique à la tyrosine et au tryptophane ?
→ 280 nm, car elle détecte uniquement leur noyau aromatique.
113
Comment choisir la longueur d’onde optimale pour analyser une protéine spécifique ? (3)
- Si on veut détecter toutes les protéines → 214 nm ou 228 nm.
- Si on cherche les acides aminés aromatiques → 254 nm ou 280 nm.
- Si on veut éviter les interférences des tampons → choisir une longueur d’onde où seuls les acides aminés absorbent.
114
Quel est le principe de base de la chromatographie d'affinité ?
→ Une liaison spécifique et réversible entre une protéine et une résine.
115
Pourquoi utilise-t-on la chromatographie d'affinité pour purifier les protéines ?
→ Car elle exploite une propriété biochimique unique de la protéine d’intérêt, permettant une purification spécifique et efficace.
116
À quelles étapes du processus de purification la chromatographie par l’affinité est-elle la plus utile ?
→ Aux deux premières étapes de la purification, pour capturer et purifier rapidement la protéine cible.
117
Quelles sont les étapes prises en charge par la chromatographie d’affinité ?
→ Capturer (isoler et concentrer)
→ Purifier (retirer les grosses impuretés).
118
Pourquoi la chromatographie d'affinité n'est-elle pas suffisante pour une purification complète ?
→ Elle ne permet pas d’éliminer les petites impuretés restantes, d’où la nécessité d’une étape de polissage (ex: filtration sur gel).
119
Quelle est la principale différence entre les protéines natives et les protéines de fusion en chromatographie d'affinité ?
→ Les protéines natives possèdent naturellement une affinité pour un ligand,
→ Les protéines de fusion nécessitent un tag ajouté par génie génétique.
120
Qu’est-ce qu’une protéine native en chromatographie d'affinité ?
→ Une protéine ayant une affinité naturelle pour un ligand spécifique (ex : ATP, NADP, métaux, cofacteurs).
121
Pourquoi utilise-t-on des protéines de fusion pour la purification ?
→ Pour faciliter la purification en ajoutant un tag d’affinité permettant une liaison forte avec une résine spécifique.
122
Quels sont trois exemples de tags d’affinité fréquemment utilisés ?
→ GST (Glutathion-S-Transferase),
→ 6xHis (Hexahistidine),
→ MBP (Maltose Binding Protein).
123
Quel ligand est utilisé pour purifier une enzyme ayant NADP⁺ comme cofacteur ?
Porcion Rouge comme ligand pour l’affinité
124
Quel ligand permet de purifier une protéine qui se lie à l’ATP ?
L’ATP est utilisé comme ligand dans la chromatographie d’affinité.
125
Comment isoler une protéine qui interagit spécifiquement avec le GTP ?
GTP immobilisé sur une matrice pour capturer ces protéines.
126
Quel type de chromatographie d’affinité est utilisé pour les protéines qui se lient aux ions métalliques ?
On utilise une chromatographie sur résine avec des ions métalliques comme Zn²⁺ ou Ca²⁺ pour piéger ces protéines.
127
Qu’est-ce qu’une protéine de fusion en chromatographie d’affinité ?
→ Une protéine modifiée avec un tag spécifique qui facilite sa purification en se liant à un ligand précis sur la résine.
128
Quel est le ligand utilisé pour la Glutathion-S-transférase (GST) ?
→ Le glutathion
129
Pourquoi l’hexahistidine (His₆) est-elle utilisée en chromatographie d’affinité ?
→ Parce qu’elle se lie au Nickel (Ni²⁺)
130
Quel est le rôle de la protéine MBP (Maltose Binding Protein) ?
→ Elle se lie au maltose
131
Qu'est-ce qu'une résine de chromatographie d'affinité ?
→ Une matrice solide (souvent en agarose ou en polymère) qui contient un ligand spécifique capable de se lier de manière réversible à une protéine d'intérêt.
132
Comment le ligand est-il fixé à la résine ?
→ Par liaison covalente, ce qui le rend très stable et résistant à la dégradation.
133
Pourquoi utilise-t-on un bras espaceur en chromatographie d'affinité ?
→ Il éloigne le ligand de la surface de la matrice,
→ Réduisant ainsi les interactions non spécifiques
→ Améliorant l’accessibilité du ligand à la protéine cible.
134
Sur quoi repose la séparation des protéines en chromatographie d'affinité ?
→ Elle repose sur l’interaction spécifique entre une protéine cible et un ligand fixé sur une résine.
135
Quelle est la différence entre les protéines avec affinité et sans affinité ?
→ Protéines avec affinité : Elles se lient spécifiquement au ligand fixé sur la matrice.
→ Protéines sans affinité : Elles ne se lient pas et sont éliminées lors des lavages.
136
Quel est le rôle du tampon de liaison lors de l’étape d’équilibration en chromatographie d’affinité ?
Il prépare la colonne en stabilisant le ligand et en créant des conditions favorables à l’interaction avec la protéine cible.
137
Que devient une protéine sans affinité pour le ligand lors de l’étape de liaison ?
Elle ne se fixe pas et est éliminée lors du lavage.
138
Comment libérer la protéine liée au ligand lors de l’étape d’élution ?
En ajoutant un compétiteur ou en modifiant les conditions de la colonne (pH, force ionique).
139
Quelles sont les trois étapes principales de la chromatographie d’affinité et leur rôle ?
1) Équilibration : Prépare la colonne avec un tampon de liaison pour stabiliser le ligand.
2) Liaison : La protéine cible se fixe au ligand, tandis que les autres protéines sont éliminées.
3) Élution : La protéine d’intérêt est libérée en ajoutant un compétiteur ou en modifiant les conditions (pH, force ionique).
140
Comment la protéine d’intérêt est-elle libérée de la résine ?
→ Par ajout d’un excès de glutathion (compétiteur) qui déplace la protéine de fusion.
141
Quelles sont les principales étapes de purification avec la chromatographie d’affinité ?
1) Expression de la protéine de fusion,
2) Liaison à la résine contenant du glutathion,
3) Élimination des impuretés,
4) Élucidation par excès de glutathion,
5) Hydrolyse par la protéase pour récupérer la protéine d’intérêt seule.
142
Que signifie "élution" dans ce contexte ?
→ L’étape où la protéine d’intérêt est libérée de la colonne grâce à un excès de glutathion.
143
Quels sont les trois principaux avantages de la fusion de GST ?
1) Augmente la solubilité de la protéine,
2) Facilite la purification avec la résine glutathion,
3) Permet une élution facile avec un petit ligand (glutathion).
144
Quels sont les trois principaux désavantages de la fusion de GST?
1) Une grosse étiquette / tag (~250 acides aminés, 26 kDa)
2) Purification n’est pas possible avec dénaturants
3) GST forme un dimère. Pas bon pour les essais biologiques
145
Que signifient "GST - 2T (T pour thrombone)" et "GST - 3X (X pour facteur X)" ?
→ Des variantes de GST fusionnées à des protéines spécifiques comme la thrombine ou le facteur X.
146
Que signifie la note « Utilise dénaturants, pas de liaison avec GST sur la résine » ?
→ Cela signifie qu’en présence d’agents dénaturants, GST perd sa capacité à se fixer à la résine, ce qui rend la purification inefficace.
147
Pourquoi est-il parfois essentiel de cliver la protéine de fusion après purification ?
→ Car les protéines de fusion comme GST et MBP sont très grosses et peuvent perturber la fonction de la protéine d’intérêt.
148
Où se trouve généralement le site de coupure pour la protéase ?
→ Il est généralement inclus dans le vecteur utilisé pour l'expression de la protéine.
149
Pourquoi est-il important de vérifier la séquence de la protéine d’intérêt avant d’ajouter un site de coupure ?
→ Pour s’assurer qu’il n’existe pas déjà un site naturel de coupure pour la protéase choisie, ce qui pourrait entraîner une digestion non spécifique.
150
Quelles sont les trois protéases les plus populaires pour cliver les protéines de fusion ?
→ La thrombine, le facteur Xa et la TEV (Tobacco Etch Virus).
151
Pourquoi est-il important que la protéine d’intérêt ne contienne pas naturellement la séquence de coupure de la protéase choisie ?
→ Pour éviter qu’elle ne soit clivée involontairement pendant l’élution.
152
Qu’est-ce que la fusion polyhistidine ?
→ C’est une technique où une séquence d’histidines (H-H-H-H-H-H) est ajoutée à une protéine pour faciliter sa purification par chromatographie d'affinité.
153
Pourquoi utilise-t-on une séquence de polyhistidine pour la purification des protéines ?
→ Parce que les histidines se lient spécifiquement aux ions nickel (Ni²⁺) immobilisés sur une résine.
154
Où est située la séquence polyhistidine dans la construction génétique ?
→ Elle est généralement insérée dans le vecteur, en amont du gène codant pour la protéine d’intérêt.
155
Quel est le rôle de la résine dans la chromatographie d'affinité avec la polyhistidine ?
→ La résine contient des ions nickel (Ni²⁺) qui interagissent avec la séquence polyhistidine de la protéine de fusion.
156
Comment la protéine liée à la résine est-elle élue ?
→ Par ajout d’un excès d’imidazole, qui entre en compétition avec les histidines et les déplace de la résine.
157
Pourquoi l’imidazole est-il utilisé comme compétiteur dans la fusion polyhistidine: ?
→ Parce qu’il a une structure similaire aux histidines et peut donc remplacer leur interaction avec les ions nickel de la résine.
158
Quels sont les avantages de la fusion poly-histidine? (4)
→ Purification facile avec résine de nickel
→ Élution facile avec un petit ligand (imidazole)
→ Purification possible avec détergents et dénaturants
→ Une petite étiquette/tag (6 acides aminés)
159
Quels sont les désavantages de la fusion poly-histidine? (3)
→ Augmente la formation de corps d’inclusion
→ La purification n’est pas possible avec antioxydants comme DTT
→ Pas bon pour la purification de protéines qui lient des métaux de transition
160
Pourquoi est-il important que la liaison entre le compétiteur et la résine soit réversible ?
→ Pour permettre l’élution contrôlée de la protéine sans la dénaturer.
161
Quels sont les critères principaux d’un bon compétiteur en chromatographie d’affinité ?
→ Il doit être spécifique mais réversible,
→ Chimiquement stable et inerte,
→ Abordable,
→ Petite taille moléculaire pour être facilement éliminé après purification.
162
Comment fonctionne la dialyse ?
→ Une membrane semi-perméable sépare la solution de la protéine du tampon extérieur.
- Les petites molécules diffusent à travers la membrane jusqu’à atteindre un équilibre,
- Tandis que la protéine reste piégée dans le tube de dialyse.
163
Pourquoi la taille de la membrane de dialyse est-elle importante ?
→ Elle doit avoir une porosité adaptée : suffisamment grande pour laisser passer le compétiteur ou les petites molécules indésirables,
→ Mais plus petite que la protéine pour la retenir.
164
Quels sont les deux principaux compétiteurs utilisés en chromatographie d'affinité ?
→ L’imidazole (utilisé pour l’élution des protéines avec une étiquette polyhistidine)
→ Le glutathion (utilisé pour l’élution des protéines fusionnées avec GST).
165
Comment l’imidazole permet-il d’éluer une protéine purifiée avec une étiquette polyhistidine ?
→ Il entre en compétition avec la séquence polyhistidine pour la liaison aux ions nickel de la résine, ce qui entraîne la libération de la protéine dans la solution.
166
Pourquoi le glutathion en excès est-il utilisé comme compétiteur pour l’élution des protéines fusionnées avec GST ?
→ Parce qu’il se lie à GST avec une plus grande affinité que la résine, ce qui provoque le détachement de la protéine de fusion GST de la résine.
