Cours 3 - Techniques et outils

Question 1

Comment caractériser la courbure de l’ADN?

Answer 1

Permutation de shift assay

Question 2

Comment déterminer la structure de la chromatine et le statut d’un gène (actif/inactif)

Answer 2

• ChIP
• Méthylation de l’ADN (MeDIP)
• ATAC-seq
• FISH
• Chromatin Conformation Capture (3C)

Question 3

Comment identifier si une protéine se fixe sur un gène?

Answer 3

• ChIP
• Luciferase reporter assay
• Gel shift assay (EMSA)
• Pull down avec oligonucléotides

Question 4

Comment éditer un génome?

Answer 4

CRISPR-Cas9

Question 5

Permutation-shift assay

Answer 5

• identifier séquences qui produisent courbure de l’ADN
• Clonage de deux fragments
• digestion du dimère avec enzymes de restriction
• produit série de fragments
• courbure centrale = retardé sur gel

Question 6

Type de méthylation pour enhancer?

Answer 6

uniméthylation

Question 7

Type de méthylation pour promoteur?

Answer 7

triméthylation

Question 8

Objectif ChIP

Answer 8

• identifier statut de la chromatine
• déterminer liaison de facteurs de transcription ou autres protéines à l’ADN

Question 9

Étapes ChIP

Answer 9

1- Figer les protéines attachées à l’ADN avec formaldéhyde
2- Fragmentation chromatine
3- Ajout Ac d’intérêt et récupération du matériel avec billes
4- Détacher protéines et digestion
5- Purification fragments
6- Analyse par PCR ou séquençage

Question 10

Comment préparer libraire pour séquençage?

Answer 10

1- Réparer fragments et phosphoryler
2- clean up
3- ajout dA-tailing
4- clean up
5- Ajout adaptateur pour amplifier
6- Clean up
7- Primer avec barcodes pour ensuite amplifier

Question 11

Analyse de ChIP-seq

Answer 11

voir exercice page 14-15

Question 12

Identification de la méthylation de l’ADN (MeDIP)

Answer 12

• immunoprécipiter adn méthylé comme ChIP
• voir méthylation de l’ADN par un traitement au bisulfite

Question 13

Avantage MeDIP

Answer 13

• cartographie au niveau du génome
• résolution à la base près

Question 14

ATAC-seq

Answer 14

• évaluer accessibilité à la chromatine
• sonde chromatine ouverte avec transposase qui insère des adaptateurs de séquençage dans les régions ouvertes du génome

Question 15

Analyse ATAC-seq

Answer 15

voir page 19

Question 16

FISH

Answer 16

• détecter et localiser la présence/absence de séquences d’ADN spécifiques

Question 17

Utilisation FISH

Answer 17

• détecter délétion ou insertion d’un gène (knock out)
• localisation d’un gène dans la cellule
• organisation spatiale du génome

Question 18

3C (Hi-C)

Answer 18

• à l’échelle du génome
• voir conformation des TADs et LADs

Question 19

Étapes Hi-C

Answer 19

1- Crosslink DNA (lie 2 brins non complémentaires)
2- enzyme de restrictions coupent
3- marque avec biotine
4- lier
5- digère et purifie
6- séquence avec les deux bouts ensemble

Question 20

Analyse Hi-C

Answer 20

Voir page 27

Question 21

ChIP seq pour protéines non histones

Answer 21

• déterminer liaison de protéines non histoniques
• regarder motifs de liaisons

Question 22

Luciferase reporter assay

Answer 22

• étudier expression des gènes
• mesurer ou suivre expression d’un gène cloné

Question 23

Analyse Luciferase reporter assay

Answer 23

Voir page 31

Question 24

EMSA

Answer 24

• test de retard sur gel
• étudier interactions protéines-ADN ou protéines-ARN

Question 25

Principe EMSA

Answer 25

- incubation d'une sonde radiomarquée avec une protéine recombinante ou un extrait de protéines nucléaires - si protéine se fixe sur la sonde, migration plus lente et bande correspondante aura migré moins loin sur le gel

Question 26

Contrôles expérience EMSA

Answer 26

- Sonde froide - Supershift

Question 27

Sonde froide

Answer 27

- sert à confirmer spécificité de la liaison - pas de marqueur - invisible sur gel, mais peut entrer en compétition avec sonde chaude - Après protéine+sonde chaude, ajoute froide en excès - bande disparaît = liaison spécifique - bande reste = pas spécifique (froide pas compétitive)

Question 28

Supershift

Answer 28

- Ajout d'un Ac dirigé contre la protéine étudiée - complexe moléculaire plus lourd, donc plus de retard

Question 29

Pull down avec oligonucléotides

Answer 29

- déterminer interactions de protéines sur une séquence spécifique d'ADN

Question 30

Pull down avec oligonucléotides Étapes

Answer 30

1- lysat cellulaire incubé avec oligo biotinylé qui correspond au site de fixation d'une protéine dans un promoteur d'un gène d'intérêt 2- Adn ensuite isolés à l'aide de billes de streptavidine et soumis à SDS page et Western blot 3- Protéine fixée ou pas?

Question 31

Contrôle important pour Pull down avec oligonucléotides

Answer 31

oligo mutant pour valider la spécificité

Question 32

Thérapie génique

Answer 32

- pénétrer gène dans cellules pour traiter une maladie - corriger gène défectueux

Question 33

avantages CRIPSR Cas9

Answer 33

- élimine besoin de construire une endonucléase personnalisée pour chaque cible - coupe/répare

Question 34

Cas9

Answer 34

endonucléase d'ADN guidée par ARN qui va couper chaque brin de l'ADN

Question 35

ARN guide (gRNA)

Answer 35

séquence cible + séquence d'échafaudage pour nucléase Cas9

Question 36

la séquence d'échafaudage est... et aide ....

Answer 36

- Toujours la même et ne change pas pas en fct de la cible - Cas9 à se lier à l'ADN

Question 37

PAM

Answer 37

- séquence immédiatement après la séquence d'ADN ciblée par nucléase Cas9 - si séquence pas suivie par PAM, Cas9 peut pas se lier ou cliver

Question 38

Réparations de l'ADN après coupure par Cas9

Answer 38

- Réparation NHEJ - réparation HDR