Cours 4-5

Question 1

L’absorption d’énergie se fait par des ….?

Answer 1

photons

Question 2

Qu’est-ce que la lumière?

Answer 2

ensemble de particules qui n’ont pas de masse (photons) mais qui ont une énergie

Question 3

Qu’est-ce qu’un rayonnement UV-Visible?

Answer 3

l’interaction avec la matière provoque des transitions électroniques (modification de l’arrangement des e¯ de valence)

Question 4

Qu’est-ce qu’un rayonnement IR?

Answer 4

l’interaction avec la matière provoque des modifications de la position spatiale des atomes autour de leur position d’équilibre par vibration d’élongation et de déformation

Question 5

Vrai ou Faux
Pour un niveau électronique, il n’existe pas plusieurs niveaux vibrationnels?

Answer 5

Faux, plusieurs niveaux vibrationnels sont divisés en niveaux rotationnels encore plus proches

Question 6

Comment nomme-t-on les molécules qui absorbent fortement la lumière dans la région des UV et visible?

Answer 6

Chromophores

Question 7

Plus la molécule a des doubles liaisons, est-ce que l’énergie et la longueur d’onde est plus élevé ou faible?

Answer 7

Plus molécules ont des doubles liaison = plus de conjugaison = plus le niveau d’énergie nécessaire est bas(moins de besoin) et longueur d’onde nécessaire élevé

Question 8

Le maximum d’absorbance correspond à une longueur d’onde appartenant à quel domaine?

Answer 8

Domaine des ultraviolets (200-400 nm)

Question 9

Quel est le processus lorsqu’un atome absorbe un photon d’énergie?

Answer 9

Un électron de valence est promu de l’état fondamental à un certain niveau de vibration de l’état excité S1 ou S2

Question 10

L’absorption de certains composés dépend de quoi?

Answer 10

la température, du pH, de présence de certains solvants

Question 11

Qu’est-ce que les auxochromes?

Answer 11

Un auxochrome est un groupement d’atomes ionisables pouvant changer l’énergie d’excitation et donc la longueur d’onde d’absorption d’un chromophore.

Question 11

Quel est le processus de la luminescence?

Answer 11

La luminescence est le phénomène d’émission de photons à partir d’une molécule dans un état électroniquement excité. En retournant à son état fondamental à partir de l’état excité, l’énergie perdue par la molécule se transforme en un photon.

Question 12

En fonction du processus physique qui a provoqué l’excitation de la molécule, on distingue quels types de luminescence?

Answer 12

*La photoluminescence (fluorescence, phosphorescence): l’énergie provient de l’absorption de photons
*la chimiluminescence : l’énergie est apportée par une réaction chimique exothermique
*la thermoluminescence : l’énergie est apportée par chauffage
*l’électroluminescence : l’énergie provient d’une décharge électrique dans des vapeurs ou des gaz
*la bioluminescence : l’énergie est produite par une réaction enzymatique dans des organismes vivants (bactéries, végétaux et animaux).

Question 13

Quelle est la fonction des fluorophores?

Answer 13

Les fluorochromes ou fluorophores sont des molécules qui absorbent l’énergie du rayonnement lumineux et leurs électrons passent à des niveaux d’énergie supérieures. Afin de pouvoir retrouver leur niveau normal d’énergie, les électrons vont la restituer sous forme de photons, en émettant une lumière d’une couleur bien précise.

Question 14

Quel est le type de diagramme qui permet de définir la fluorescence?

Answer 14

Diagramme d’énergie de Jablonski

Question 14

Vrai ou Faux
Un fluorophore est un chromophore qui réémet un photon absorbé avec une énergie plus élevé?

Answer 14

Faux
Un fluorophore est un chromophore qui réémet un photon absorbé avec une énergie plus faible (λ plus longue)

Question 15

Le photon de fluorescence émis à une λ plus longue ou plus courte que le photon absorbé?

Answer 15

une λ plus longue

Question 16

Vrai ou Faux
La molécule peut regagner l’état fondamental à partir du niveau de vibration le plus bas excité.

Answer 16

Faux
La molécule ne peut regagner l’état fondamental qu’à partir du niveau de vibration le plus bas de l’état excité S1

Question 17

Qu’est-ce qu’un spectre d’excitation?

Answer 17

on fait varier la longueur d’onde d’excitation, et on enregistre l’intensité d’émission à une seule longueur d’onde (habituellement la longueur d’onde de l’intensité d’émission maximale).

Question 18

Qu’est-ce qu’un spectre d’émission?

Answer 18

on excite avec une longueur d’onde d’excitation, en général la longueur d’onde d’excitation maximale, et on mesure l’intensité de fluorescence aux différentes longueurs d’onde d’émission.

Question 19

Vrai ou Faux
Les 2 spectres d’excitation et d’émissions sont asymétriques

Answer 19

Faux
Les 2 spectres sont en général symétriques, mais décalés au niveau des longueurs d’onde

Question 20

Qu’est-ce que le déplacement de stokes?

Answer 20

Chevauchement entre les deux spectres

Question 21

Vrai ou Faux
La forme du spectre d’émission est indépendante de l’énergie d’excitation

Answer 21

Vrai
La forme du spectre d’émission est indépendante de l’énergie d’excitation (longueur d’onde) à cause de la conversion interne rapide des états excités initiaux supérieurs au niveau d’énergie vibratoire le plus bas de l’état excité de S1.

Question 22

Vrai ou faux
L’intensité de la lumière émise est proportionnelle à l’énergie requise pour exciter un fluorophore à toute longueur d’onde d’excitation

Answer 22

Vrai

Question 23

Combien il y a de lamda max pour le spectre d'émission? Et pour le spectre d'excitation?

Answer 23

1 seul pour spectre d'émission et plusieurs pour spectre d'excitation

Question 24

Vrai ou Faux Niveaux énergétiques identiques pour le spectre d'émission et spectre d'excitation

Answer 24

Vrai, mais pk?

Question 25

Quel est le rendement de fluorescence?

Answer 25

c’est le rapport nombre de photons émis / nombre de photons absorbés

Question 26

Nommez 5 aspects qui influencent la fluorescence

Answer 26

Polarité Ions Potentiels électrique Inhibiteurs Température Viscosité Pression pH Liaisons hydrogène

Question 27

Un bon fluorochrome est une molécule rigide ou molle?

Answer 27

Molécule rigide pour limiter les pertes non radiatives par vibration et rotation

Question 28

Si la température augmente, quel est l'impact sur la fluorescence?

Answer 28

si la température augmente, les processus non radiatifs liés à l’agitation thermique (collisions intermoléculaires, vibrations et rotations intramoléculaires) augmentent, et le rendement de fluorescence diminue

Question 29

Si on diminue la viscosité, quel est l'impact sur la fluorescence?

Answer 29

Diminution de fluorescence à cause de la hausse de l'agitation

Question 30

En phosphorescence , est-ce que les électrons retournent rapidement à leur état fondamental?

Answer 30

Non les électrons ne retournent pas rapidement à leur état fondamental comme la fluorescence

Question 31

Quelles sont les caractéristiques des Infra-Rouge?

Answer 31

* La spectroscopie IR mesure la fréquence de vibration des liaisons covalentes * Elle est utilisée pour identifier des groupements fonctionnels (i.e. liaisons chimiques O-H, N-H, C-H etc…) * L’absorbance suit la loi de Beer- Lambert * Elle ne dose pas directement un constituant mais quantifie le nombre de liaisons chimiques * Elle est applicable à n’importe quel type d’échantillon: liquides, solides, gaz, mélanges complexes.

Question 32

À quoi sert les empreintes infrarouges au contrôle qualité?

Answer 32

Fourni des informations sur la structure et la composition chimique des échantillons étudiés

Question 33

Comment rendre une protéine d'intérêt invisible, visible?

Answer 33

Étiquetage moléculaire (4 types)

Question 34

Quel est le principe de l'étiquetage avec un épitope?

Answer 34

Ajout d’un tag constitué d’un codon d’initiation ou stop selon si en N-term ou C-term Souvent utilisé pour détecter des anticorps Détecter par immunofluorescence (cellules fixées sur lamelle de verre, protéine d’intérêt avec anticorps et fluorophores)

Question 35

Quel est le principe de l'addition d'une protéine fluorescente?

Answer 35

Ajout de GFP pour étiquetage moléculaire

Question 36

Quel est le principe d'un ajout d'enzyme ou tag de fusion pour l'étiquetage moléculaire?

Answer 36

Ajout d'un enzyme qui permet la fluorescence du substrat, cela permet de voir la localisation

Question 37

Quel est le principe de l'ajout tag tétracystéine pour l'étiquettage moléculaire?

Answer 37

Protéine d'intérêt fusionné génétiquement qui permet de former des complexes et ainsi fluorescé Doit avoir une molécule organique et protéine fluorescente

Question 38

Dans un microscope à fluorescence INVERSÉ, est-ce que les objectifs sont sous ou au dessus de la lentille?

Answer 38

Les objectifs sont sous la lentille pour un microscope inversé.

Question 39

Quelle est la particularité de la microscopie à (épi)fluorescence?

Answer 39

L’échantillon est éclairé par une lumière d’excitation et la lumière émise – la fluorescence – est détectée par le même objectif.

Question 40

Quelle est la limite de résolution dans un microscope?

Answer 40

Limite de diffraction de la lumière

Question 41

Quels sont les deux inconvénients de la microscopie à fluorescence?

Answer 41

1- Photoblanchiment 2- Perte de résolution

Question 42

Qu'est-ce que le principe du photoblanchiment?

Answer 42

Le photoblanchiment est un dommage irréversible du fluorophore suite à une modification covalente induite par les photons en présence d’oxygène (radicaux libres). Solution: agents anti-blachiement qui réduisent la concentration d’O2 et donc la formation de radicaux libres.

Question 43

Quelle est la cause de la perte de résolution?

Answer 43

Perte de résolution dûe à l’émission de fluorescence défocalisée qui se superpose à l’image du plan focal d’intérêt

Question 44

Quelles sont les deux façons d'éliminer l'information hors focus?

Answer 44

- Microscopie confocale - Microscopie multiphotons

Question 45

Quelle est la grosse particularité de la microscopie confocale?

Answer 45

Grosse différence : Utilisation de laser au lieu de lampe et a un diaphragme d’émission pour bloquer la lumière hors focus

Question 46

Qu'est-ce que permet le rayon laser lors de la microscopie?

Answer 46

Le rayon laser illumine une partie restreinte du spécimen donc moins de fluorescence défocalisée et donc une meilleure préservation de l’échantillon.

Question 47

Vrai ou Faux La microscopie à fluorescence a une meilleure préservation de l'échantillon que la microscopie confocale?

Answer 47

Faux, la microscopie confocale a une meilleure préservation de l'échantillon.

Question 48

Vrai ou Faux Est-ce que la microscopie multiphoton a les mêmes avantages que le microscope confocal?

Answer 48

Vrai

Question 49

Quel type de microscope a la meilleure préservation de l'échantillon puisqu'il est plus focalisé?

Answer 49

Microscopie multiphoton

Question 50

STED fait partie de quel type de microscope?

Answer 50

Microscopie à fluorescence haute résolution

Question 51

À quoi sert la microscopie à fluorescence haute résolution?

Answer 51

Très grande résolution permettant de voir toutes les structures internes et externes

Question 52

Comment faire pour évaluer la mobilité d'une protéine?

Answer 52

Le processus de photoblanchiment permet d'éliminer la fluorescence et selon la diffusion des fluorophores, si les fluorophores vont au spot de photoblanchiment, quelques minutes plus tard et ça ne parait plus, ce qui détermine une protéine mobile.

Question 53

Quelles applications sont utiles pour voir les protéines en action?

Answer 53

- FISH : voir localisation - FLIP : mobilité et diffusion - BiFC: voir interactions - FRET : spectre d'émission et excitation de la fluorescence -BRET : interaction substrat et luciférase : meilleure préservation de l'échantillon

Question 54

Comment définir la densité électronique?

Answer 54

Les atomes et molécules sont définis généralement par la probabilité de trouver un électron dans l’espace

Question 55

Vrai ou Faux Est-ce que la cristallographie aux rayons X est utile pour déterminer les structures atomiques?

Answer 55

Vrai

Question 56

Quel est le premier prix Nobel sur la Cristallographie et quand?

Answer 56

Découverte des rayons X par Rontgen en 1895 – Prix Nobel en 1901

Question 57

Quel est le dernier prix Nobel sur la Cristallographie et quand?

Answer 57

Structure cristalline d’une RCPG lié à un ligand diffusible par Stevens et Kobilka en 2007 – Prix Nobel en 2012

Question 58

À quoi sert Protein Data Bank (PDB)?

Answer 58

* Effort pour intégrer et valider les modèles atomiques multidisciplinaires * Contient plus de 210180 structures déposées (X-ray, NMR and CryoEM) * 64 000 structures humaines

Question 59

Vrai ou Faux La diffraction des rayons X sur un objet moléculaire arrive très souvent

Answer 59

Faux, la diffraction des rayons X sur un objet moléculaire est très rare, la majorité des rayons passent au travers

Question 60

Est-ce qu'il existe des lentilles pour focuser les rayons X diffractés?

Answer 60

Non

Question 61

Vrai ou Faux Est-ce que les photons qui rencontrent des atomes auront des phases différentes après la réflexion?

Answer 61

Vrai, phases différentes suite à la réflexion et un phénomène d’interférence apparaît entre les photons réfléchit d’un cristal, résultant en l’émission d’un patron de diffraction qui dépendra de la position relative des atomes dans le cristal.

Question 62

Quel type de collection de diffraction peut récolter des cristaux plus petits?

Answer 62

Collection de diffraction en série

Question 63

Quel type de collection de diffraction a une acquisition des cristaux de façon cryogénique?

Answer 63

Collection de diffraction au synchrotron

Question 64

Comment fait-on pour faire croitre des cristaux de protéines?

Answer 64

* Pour former des cristaux de protéines, on mélange une protéine concentrée avec une solution de précipitant. * Le précipitant peut être formé de sels, de solvant et de polymères. Il faut trouver la bonne recette! * La concentration du précipitant et parfois aussi celle de la protéine est augmentée lentement.

Question 65

Quelles sont les méthodes de croissance de cristaux?

Answer 65

-Méthodes par diffusion de vapeur -Méthode de lipide en phase cubique (LCP) -Micro-batch -Micro-dialyse -Diffusion à interface libre -Ensemencement

Question 66

Qu'est-ce qu'un cristal?

Answer 66

Un cristal est formé par la répétition de cellules unitaires identiques dont les côtés forment un réseau d’arêtes et de sommets

Question 67

Qu'est-ce qu'un réseaux de Bravais (lattice)?

Answer 67

Un réseau de Bravais est l’agencement d’un système cristallin et positionnement des molécules dans une cellule unitaire.

Question 68

Une cellule unitaire primitive (P) a combien d'objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?

Answer 68

8 protéines sur les sommets 1 objet/cellule unitaire

Question 69

Une cellule unitaire (I) a combien d'objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?

Answer 69

8 protéines sur les sommets + 1 protéine au centre 2 objet/cellule unitaire

Question 70

Une cellule unitaire (F) a combien d'objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?

Answer 70

8 protéines sur les sommets et 8 autres protéines au centre de chaque surface 4 objet/cellule unitaire

Question 71

Combien il y a de groupes d'espaces possible?

Answer 71

65

Question 72

Qu'est-ce qu'un groupe d'espace?

Answer 72

La symétrie de la position des protéines dans un cristal est décrite par le groupe d’espace

Question 73

Quel système cristallins est plus symétrique et lequel le moins symétrique?

Answer 73

+ symétrique : cubique - symétrique : Triclinic

Question 74

Nommez un exemple de groupe d'espace

Answer 74

C2 = tourne 180 degré

Question 75

Comment appelle-t-on tous les points dans un patron de diffraction?

Answer 75

Réflection

Question 76

Qu'est-ce que l'indice de Miller ?

Answer 76

Méthode décrivant l’orientation d’un plan ou d’un ensemble de plans coupant une cellule unitaire

Question 77

Que signifie hkl?

Answer 77

h = coupe l'axe des X k = coupe l'axe des Y l = coupe l'axe Z ( 0 si en 2D)

Question 78

Que représente l'indice de Miller?

Answer 78

Décrit la densité électronique

Question 79

Vrai ou Faux Plus il y a de réflexions, moins la résolution est bonne?

Answer 79

Faux, plus il y a de réflexions , plus la résolution est meilleure (et mieux sur les bords car plus de diffraction)

Question 80

Qu'est-ce qu'un facteur de structure?

Answer 80

Réflexion X la phase

Question 81

Vrai ou Faux Tous les spots sur un patron de diffraction ont la même phase?

Answer 81

Faux, tous les spots ont une phase différente

Question 82

Quelles sont les 7 étapes entre la collection de la diffraction et l'assemblage des données?

Answer 82

1- Collection de la diffraction : La plupart du temps sur plusieurs cristaux. Plusieurs ensembles de données. 2- Indexation : Trouver les réflexions dans le signal, attribution des indices de Miller et déterminer le groupe d’espace. 3- Integration: Déterminer l’intensité de chaque réflexion indexée et le bruit de fond. Contrôle de qualité. (fait par logiciel) – éliminer bruits de fond 4- Écaillage (scaling): Assembler les différents ensembles de données en 1 ensemble complet et normaliser le signal (comme des ELISA!). 5- Phasage (phasing): Déterminer un ensemble de phases initiales à attribuer à chaque réflection pour déterminer les facteurs de structure. Plusieurs approches sont possibles. Si des phases sont trouvées, la structure est considérée résolue de manière initiale à cette étape. 6- Raffinement: Processus itératif (bootstrapping) de modification de la structure obtenue dans le but de converger vers les phases réelles. 7- Validation: Est-ce que le modèle est cohérent avec la densité électronique? Est-ce que la géométrie des acide aminés ou autres molécules fait du sens (contrainte chimique) ?

Question 83

Quelles sont les méthodes de phasage?

Answer 83

1- Méthode directe (pour les petites molécules chimiques) – essayer toutes les phases 2- Remplacement moléculaire (99% du temps) 3- Remplacement isomorphe (isomorphous replacement (SIR, MIR)), utilisation des atomes lourds toxiques 4- Dispersion anormale (anomalous dispersion (SAD, MAD)) utilisation de selenomethionine

Question 84

Comment fonctionne le remplacement moléculaire?

Answer 84

On connait un indice de Miller pour chaque spot détecté pour notre diffraction, il manque seulement les phases. On connait les phases d’une protéine similaire donc on peut approximer les phases, en faisant une transformé de Fourrier de la protéine connue, et on obtient un patron avec les phases pour chacune des réflexions. Les phases découvertes seront appliquées au patron de diffraction mesuré pour refaire une transformé inverse et mettre notre modèle pour remoduler et recommencer le cycle.

Question 85

Combien % d'identité faut-il au minimum pour faire un remplacement moléculaire lors du phasage?

Answer 85

40%

Question 86

Qu'est-ce que le B-factor?

Answer 86

* Le paramètre de déplacement isotropique (B-factor) est une mesure le désordre statique entre atomes équivalents de différentes cellules unitaires et de la vibration dû à la température.

Question 87

Que signifie l'occupation moléculaire?

Answer 87

* L’occupation (occupancy) est une mesure de la position alternative d’atomes (souvent de chaînes latérales) dans un cristal. Il s’exprime en fraction d’occupation. Par exemple, les atomes d’une chaîne latérale retrouvée dans 2 conformations, 1 chaîne protéique sur 2, possèdent un occupancy de 0.5.