Eiwitten & Enzymen Flashcards
(102 cards)
1
Q
Verschil chemische reactie en een fysisch proces
A
Bij chemisch verschuiven covalente bindingen en bij fysisch niet
2
Q
Waarvoor gebruik je thermodynamica?
A
Om te kijken of en welke kant een reactie op loopt
3
Q
Eerste en tweede hoofdwet van thermodynamica
A
Wet van behoud van energie & processen lopen alleen als mate van chaos (entropie) toeneemt
4
Q
Entropie (S)
A
Mate voor diffusie van energie. Als energie op meer manieren is te delen, is entropie toegenomen.
5
Q
Energiekosten bij processen in de cel
A
Het kost energie om op het gewenste moment de gewenste conformatie te hebben
6
Q
ΔGibbs vrije energie
A
Maat of processen wel of niet verlopen.
7
Q
Enthalpie (H)
A
Energie-inhoud (verlaagt als bindingen)
8
Q
ΔG=ΔH-T*ΔS, wanneer verloopt proces?
A
Als ΔG negatief is, want streven naar zo laag mogelijke energie. Afweging van bindingen en vrijheid tot relatie met temperatuur. (Je wil enthalpie laag en entropie hoog)
9
Q
Waarvoor zoek je de G0 (standaard Gibbs vrije energie) op, bereken je de ΔG0 en zet je in berekening ΔG op nul?
A
Voor berekenen bij welke verhouding van de beginstoffen en producten de reactie in evenwicht is
10
Q
Evenwicht van reacties
A
Als er netto geen reactie plaatsvindt, deze verandert niet! (Daarom kan je beetje product wegvangen en zal beginstoffen weer netto reageren tot product)
11
Q
Ook ongunstige reacties kunnen verlopen, hoe?
A
Door er energie in te stoppen (via tussenstappen), het gaat niet meteen terug door de activeringsenergie
12
Q
Exotherme en endotherme reactie
A
Exotherme reactie liever, want lagere energie bij producten
13
Q
Hoe wordt de activeringsenergie overwonnen?
A
Doordat moleculen niet stil staan, door conformatie veranderingen verandert energie van eiwit net een beetje. Enzymen helpen hiermee
14
Q
Hoe reacties laten verlopen die niet spontaan gaan?
A
Wegvangen van product of
koppelen aan andere reactie met een sterke negatieve ΔG. Dus je stopt er energie in (om dingen in juiste volgorde te laten verlopen)
15
Q
Waarom vouwt eiwit op bepaalde manier?
A
Het wil een conformatie met een zo laag mogelijke Gibbs-vrije energie, ligt aan omgeving (waterig of niet).
16
Q
Katalysator/enzym
A
Versnelt reactie naar evenwicht door activeringsenergie te verlagen. Altijd verhoogde energie, tot binden aan substraat waar ze energie aan geven voor activeringsenergie. Het reageert zelf niet mee en zorgt ook voor organisatie in de cel.
17
Q
Reactie enzym
A
S+E -> ES -> EP -> P+E
18
Q
Stratagiën enzym
A
- Reactanten bij elkaar brengen
- Ladingen substraat veranderen
- Conformatieverandering (ongunstigere toestand)
19
Q
Induced-fit
A
Als substraat aan active site bindt zorgt het voor conformatieverandering in enzym
20
Q
Co-factor en prosthetische groep
A
Bindt aan enzym. Organisch of anorganisch, deze kan mee reageren. Prosthetische groep is een zeer vast gebonden co-factor
21
Q
Overgangstoestand
A
Tussen substraat en product, bij de activeringsenergie
22
Q
Protease
A
Enzym dat eiwit knipt. Eiwit bindt in reactieve bindingspocket
23
Q
Stabiliseren in thermodynamica
A
Verlagen van de energie
24
Q
Welke groepen in katalytisch centrum?
A
Ladingen, want bindingen verbreken
25
Oxyanion-gat
Hierin O- stabiliseren bij protease
26
Betasheets en betastrand (secundaire structuur eiwit)
Meerdere betastrands bij elkaar vormen een betasheet, die kan parallel of antiparallel zijn
27
Inter en intra moleculaire bindingen
Inter: tussen moleculen
Intra: binnen één molecuul
28
Eiwit structuur bepalen door ... (3 manieren)
Röntgendiffractie: eiwit laten kristalliseren en bestralen met röntgen waardoor een interferentiepatroon ontstaat. Resolutie is belangrijk!
NMR (MRI): gebeurt in oplossing, waardoor conformaties/tussenvormen bekijken. Kijken wanneer spin van atoomkern omklapt.
Cryo-EM: eiwit in oplossing indrogen, duizenden foto's van allerlei kanten
29
Post-translationele modificatie
Modificeren van eiwit na translatie, kan 3D structuur drastisch beïnvloeden, bijv fosforylatie.
30
Myoglobine en hemoglobine
Myo: 1 subunit, O2 opslaan in spieren/weefsel
Hemo: 4 subunits, transport O2 van longen naar weefsels
Er zit heem (prostetische groep) in de hydrofobe groep
31
Globulair eiwit
Eiwit heeft een soort bolvorm 3D
32
Heem
Prostetische groep van myo/hemoglobine met Fe2+ (4 bindingen, dus 2 over)
33
1Å
0,1 nm
34
Coöperatieve binding
Snel binden als ander ook bindt, sneller loslaten als ander ook los laat. Affiniteit hangt af van concentratie
35
Heeft hemo of myoglobine een hogere affiniteit voor O2? En waarom?
Myoglobine heeft een hogere affiniteit. Dat is zo omdat het O2 van hemoglobine (bloed) naar myoglobine (spier) moet gaan.
36
Wat gebeurt met het Fe-atoom in de heemgroep (in hemoglobine) als O2 bindt? En andere gevolgen?
Dan wordt die in het vlak getrokken, waardoor proximale histidine ook verplaatst. Er worden zoutbruggen verbroken en draaiing subunits
37
R- en T-state van hemoglobine
R: relaxed (gebonden)
T: tense (los), instabieler
Kansproces!
Twee modellen: concerted (omklappen) sequentieel (tussenvorm)
38
T-state hemoglobine is instabieler, dus moet je stabiliseren bij weefsels om O2 goed los te laten. Hoe gebeurt dat?
Met het molecuul 2,3-BPG, deze bindt in gat in het midden (neg aan pos lysine)
39
Hoe kan het dat de baby hemoglobine heeft met een hogere affiniteit voor O2 dan de moeder? En waarom is dat zo?
De baby moet O2 overnemen van de moeder. De baby heeft geen β maar γ ketens. Histidine vervangen door serine zodat 2,3-BPG minder goed bindt. Dus vaker in R dan T.
40
Wat is het bohr effect en hoe werkt het op moleculair niveau?
CO2 en H+ verlagen affiniteit voor O2.
H+: T-state stabiliseren door positief geladen histidine (door lagere pH) die bindt met neg Asp. Hierdoor ergens anders nog een zoutbrug.
CO2: bindt aan N-terminus (carbamylering) waardoor vorming zoutbrug.
41
Allosterische regulatie
Regulatie van activiteit/functie van een eiwit doordat een molecuul ergens bindt op een andere plek dan het actieve centrum. Vaak verandering quartenaire structuur. Deze enzymen hebben een sigmoïdale curve als de reactiesnelheid tegen substraatconcentratie wordt gezet
42
Sikkelcel anemie
Mutatie in hemoglobine van glutamaat naar valine, van geladen naar polair. Hierdoor klontering van de valines samen.
43
Commited step (bij allosterie)
Als die stap uit wordt gevoerd lopen de andere reacties (ongereguleerd) door. Het 'beslispunt'.
44
Purine en pyrimidine
Purine: A & G
Pyrimidine: T & C
45
Enzymkinetiek
Werking en snelheid van enzym, uitgedrukt in Vmax en Km
46
Vmax en Km
Hoeveel substraat kan een enzym maximaal omzetten per tijdseenheid.
Bij welke concentratie is de halve Vmax bereikt.
47
Twee enzymen die zelfde substraat omzetten, naar ander product met andere snelheid bij zelfde concentratie. Functie bij bijv glucose?
Als je weinig substraat hebt dan ga je product omzetten (bijv glucose -> energie), bij veel substraat ga je beide producten maken (maximale energie maken, andere glucose -> opslaan)
48
Voor welk enzym is makkelijker een remmer te maken, met lage of hoge affiniteit voor substraat?
Enzymen met een lage affiniteit voor het substraat is makkelijker een remmer te maken
49
Aannames bij Michaelis-Menten, en waarom zijn deze handig?
1) Je hebt veel meer substraat dan enzym (zodat hoeveelheid substraat op tijdstip 0=hoeveelheid toegevoegd substraat)
2) Enzym en substraat zijn net bij elkaar (Vo) (dus geen P, dus geen k-2, vorming product afhankelijk van k1, k-1 en k2)
50
Steady state
Concentratie ES is constant (k1[E][S]=(k-1+k2)[ES]
51
Km
(k-1+k2)/k1
De substraat concentratie waarbij Vo=1/2Vmax
52
Wanneer bereik je de Vmax?
Als alle enzymen in de ES toestand is, dus allemaal substraat gebonden
53
Michaelis-Menten vergelijking
Vo=Vmax ([S]/ ([S]+Km))
54
Wat is de maximale waarde van de breuk in de MM-vergelijking?
[S]/ ([S]+Km)
dus maximaal 1, logisch want Vo is maximaal 1x de Vmax
55
Hoe maak je een MM-plot?
Door de Vo te bepalen bij verschillende substraatconcentraties. Die bepaal je door raaklijn is t=0 bij product uitzetten tegen tijd bij verschillende substraatconcentraties
56
Waar is de snelheid van het enzym het meest te bufferen/sturen?
Rond de Km, kleine verschillen in substraatconcentraties verandert de snelheid meer dan bij andere plekken
57
Lineweaver-Burk vergelijking uit de MM-vergelijking en waarom handig?
MM-vergelijking 1 gedeeld door doen, en wat schuiven zodat rechte lijn (y=ax+b), dan hoef je minder te meten.
1/Vo=1/Vmax + Km/Vmax * 1/[S]
58
Enzym remmers
Veel medicijnen werken zo, deze veranderen de enzymkinetiek
59
Drie klassen van reversibele remmers van enzymen
Competitive inhibitor: competitie met substraat voor active site.
Uncompetitive inhibitor: bindt aan ES-complex, stabiliseren
Noncompetitive inhibitor: bindt aan enzym en zorgt voor conformatieverandering
60
Enzymkinetiek verandering bij competitive inhibitor
Km wordt groter
Vmax blijft gelijk
61
Enzymkinetiek verandering bij unncompetitive inhibitor
Km wordt kleiner
Vmax wordt lager
62
Enzymkinetiek verandering bij noncompetitive inhibitor
Km blijft gelijk
Vmax wordt lager (want lijkt alsof je minder enzym hebt)
63
Irreversibele inhibitors van enzymen
Binden covalent, niet meer terug te draaien. Qua kinetiek lijkt deze op noncompetitive inhibitor, je raakt namelijk enzym kwijt (doordat inhibitor irreversibel bindt). Bindt (vaak?) aan reactieve katalytisch centrum.
64
Suicide inhibitor/substrate analoge
Irrevisibele remmer van enzym die lijkt op het substraat, maar covalent zal binden. Specifiek maken door groepen er aan te maken zodat het in de pocket past van het enzym.
65
Regulatie enzym door proteolyse
Enzym wordt inactief gemaakt en er moet nog een stukje afgeknipt worden voor ze actief zijn (bijv eiwit knippende enzymen gemaakt in pancreas)
66
Regulatie enzym door post-translationele modificatie
Reguleert bijvoorbeeld de plek in de cel, of active site toegankelijk maken dan wel blokkeren.
67
Regulatie enzym door eiwit-eiwit interactie
Subunits binden aan enzym (bijvoorbeeld allosterische regulatie)
68
Hoe kan je enzymen reguleren?
Eiwit-eiwit interacties, post-translationele modificatie, inhibitors, proteolyse
69
Proteoom
Alle eiwitten die in de cel/het organisme aanwezig zijn (meer eiwitten dan genen)
70
Analytisch vs preparatief onderzoek naar eiwitten
Anlaytisch: welk en hoeveel eiwit aanwezig
Preparatief: opzuiveren van actief eiwit
71
Hoe karakteriseer je eiwitten/wat is de functie?
Vanalles: aminozuurvolgorde, molecuulgewicht, 3D structuur, activiteit/enzym, waar en wanneer in de cel,...
72
Gel-elektroforese
Eiwitscheiding (analytisch) waarbij je eiwitten scheidt door een gel op basis van lading en vorm/grootte. Gel moet chemisch inert zijn/niet snel reageren
73
SDS-page
INACTIEF! Variant van gel-elektroforese waarbij je je eiwit ontvouwt (SDS) en lading per massa wordt hetzelfde, negatief. Dus je scheidt alleen op basis van grootte. Loopafstand is evenredig met het logaritme van de molecuulmassa, marker/ladder nodig.
74
Simply-Blue stain
Detectie na eiwitscheiding met SDS-PAGE, het is een kleurstof.
75
Iso-electric focussing
In een gel zit +een pH-gradiënt. De eiwitten zullen dus naar het iso-elektrisch punt gaan (pH waarbij netto lading nul is)
76
2D Elektroforese
Eerst iso-elektric focussing daarna SDS-PAGE
77
Doel zuivering eiwitten
Zo hoog mogelijke activiteit krijgen met zo min mogelijk verschillende eiwitten
78
Dialyse
Opgeloste eiwitten scheiden van veel kleinere andere moleculen met behulp van een semi-permeabel dialyse-membraan. (Het scheidt dus geen eiwitten van elkaar)
79
Buffer-wissel met dialyse
Eiwitten in membraan in buffer 1, in een groot vat met buffer 2 stoppen, de eiwitten blijven zitten en buffer wisselt uit. Meerdere keren herhalen voor betere wissel
80
Gel-filtratie
Kolom met bolletjes met kleine gaatjes. Kleine eiwitten blijven hier in zitten en grote niet. Kleine hebben dus een langere weg. Grote eiwitten komen er eerst doorheen, daarna de kleine
81
Ionenwisselaar
Kolom met bolletjes die een lading hebben. Eiwitten met een tegengestelde lading zullen binden (hangt af van pH!) en gaan langzamer door de kolom. Binding verbreken met zoutgradiënt: elutie.
Anionenwisselaar: bindt anionen, dus is zelf +
Kationenwisselaar: bindt kationen, dus is zelf -
82
Ultra-centrifugatie
Scheiden op basis van dichtheid (massa/volume). Hangt af van dichtheid deeltje en oplossing.
83
Differentiële centrifugatie
Eerst rustig afdraaien, meer, meer etc. Zodat je steeds wat ander afgentrifugeerd. (Cellen hiervoor lyseren)
84
Weefsels/cellen stukmaken kan op 2 manieren
Homogenaat: mechanisch kapotmaken
Lysaat: membraan lek maken vaak door zeep (rip enzym)
85
Gradiëntcentrifugatie
In buisje gradiënt van dichtheid maken, zo gaan de eiwitten bij hun eigen dichtheid zitten en kan je ze om de beurt eruit laten lopen
86
Antilichamen (Ab)
Heeft meerdere domeinen en kan specifiek en sterk binden aan iets. Gemaakt door B-cellen van immuunsysteem.
87
Primaire en secundaire antilichamen
Primair: herkent specifiek eiwit
Secundair: herkent primaire antilichamen uit specifiek dier (hier kan je label aanhangen voor detectie)
88
Versterkingsstap bij antilichaam kleuring
Als secundair wordt gebruikt voor kleuring binden er twee aan de primaire. De secundaire heeft een detectie-groep.
89
Antigen en epitoop
Epitoop is het deel van het antigen wat herkent wordt door het antilichaam
90
Poly- en monoklonaal antilichaam
Poly: mix van Ab die meerdere epitopen van zelfde antigen herkennen
Mono: zuiver antilichaam dat maar één epitoop herkent
91
Affiniteits-chromotografie
Kolom met bolletjes met antilichaam voor specifiek eiwit. Andere eiwitten gaan erdoorheen, daarna elueren met buffer zodat eiwit van interesse er af gaat
92
Immuno-precipitatie
Bolletjes met Ab in epje met eiwitmengsel. Centrifugeren zodat bolletjes met gebonden eiwit onderaan, dan supernatant weg pipeteren. Dan elueren met buffer zodat eiwit los van Ab.
93
Eiwitkleuring kan algemeen en specifiek
Algemeen: kleuring die aan alle eiwitten bindt
Specifiek: met antilichaam aan één eiwit
94
Eiwit detectie met antilichamen, principes
1) Eiwitten vastmaken op drager en Ab eroverheen + wassen
2) Andersom (wel twee primaire Ab met andere epitopen nodig)
3) Eiwit van interesse vastmaken op drager, antilichamen erbij wassen en met secundair Ab kijken of er een Ab was die is gebonden
95
Western Blot
Meestal na SDS-PAGE. Eiwitten van gel naar membraan mbv stroom. Met specifiek Ab eiwit binden en detectie met secundair Ab.
96
Immuno-fluorescentie
In gefixeerde cel eiwitten kleuren om te kijken waar welk eiwit zit
97
GFP-eiwit
Fluorescente kwalleneiwitten, gebruiken voor detectie.
98
Massa-spectrometrie
(Kan na SDS-PAGE) Eiwit in stukjes knippen, deze in massaspectrometer stoppen. Fragmenteren door laser met elektronen erop te schieten. De grotere/zwaardere gaan langzamer, tijd wordt gemeten. Bepaalde tijden horen bij bepaalde aminozuurvolgordes.
99
Positieve aminozuren (3)
Lysine, arginine en histidine
100
Negatieve aminozuren (2)
Aspartaat en glutamaat
101
Polaire ongeladen aminozuren (6)
Cystine, serine, threonine, asparagine, tyrosine en
glutamine
102
Apolaire aminozuren (9)
Glycine, alanine, valine, leucine, methionine, isoleucine, proline, fenylalanine en tryptofaan
