F25 - Kromatografiska metoder för biomolekyler

Question 1

Immobiliserad metalljon kromatografi (IMAC)

Answer 1

• Bygger på att vissa produkter binder metalljoner.
• Proteiner kan binda metaller framförallt genom att binda histidin- eller cystinsidokedjor.
• Vanliga metaller: Ni2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, av dessa är Cu2+ den som binder starkast till proteinet, och här räcker det med en enda histidinsidokedja föra att få en skapligt stark bindning ´. De övriga kräver minst 2 intilliggande histidiner.

Question 2

Villkor för IMAC?

Answer 2

Det går ut på att låta metalljon binda till kolonnen.
• Detta görs med förbehandling med lämplig 0.1M lösning av lämpligt salt, oftast sulfat eller klorid.
• Sedan sköljer man bort överskott och ekvilibrerar med startbuffert.
• Sedan applicerar man sitt prov i start buffert.
• Efter allt ska intressanta proteiner fastna.

Question 3

Vilka är de olika sätt att eluera de proteiner som har fastnat (IMAC)?

Answer 3

• Sänk pH så att sidokedjor som koordinerar metallen protoneras, så att de inte längre funkar som ligander.
• Tillsats av fri ligand som tävlar med proteinet om koordinationsplatserna.
• EDTA, binder alla metaller som EDTA-komplex.

Question 4

Kovalent/tiol kromatografi.

Answer 4

• Innebär att utnyttjande av kovalenta dislufidbindningar för att fästa proteiner på en kolonn.
• Man utnyttnjar att disulfidbindningen är stabil under oxiderande förhållanden, men bryts vid reduktion.

Question 5

Tillvägagångssätt av kovalent/tiol kromatografi samt eluering.

Answer 5

• Man startar med kolonnen i dislufidform. En fri tiolgrupp i ett protein kan då fungera som nukelofil i en SN2-reaktion på den svavelatom som är bunden till separås matrisen, medan det andra svavlet och dess organiska substituent utgör en lämnande grupp.
• Eluering kan sedan ske med överskottet av tiol.

Question 6

Färgämnesbindnings kromatografi.

Answer 6

• Man använder färgämnen med ursprung textilindustrin för att adsorbera proteiner.
• Nukleotider binder till proteiner/enzymer.
• Hög affinitet.

Fler bindningsmekanismer:
• Affinitetsliknande interaktioner
• Elektrostatisk bindning
• Hydrofobisk binding 
Pga de sista 2 kan eluering ofta ske genom förändring av pH och/eller jonstyrka.

Question 7

Vad är de konstanta och variabla delarna av antikropparna?

Answer 7

• Konstant: Delar av strukturen är gemensam för alla antikroppar.
• Variabla: Ger specifik bindning till en ligand som kallas antigen.