Fluorimetrie

Question 1

Was ist Lumineszenz und in welche Unterarten lässt sie sich einteilen?

Answer 1

Lumineszenz ist die Emission von Licht im sichtbaren, UV- und IR-Spektralbereich von Gasen, Flüssigkeiten und Festkörpern nach Energiezufuhr. -> Übergang von einem Elektron aus einem energetisch höheren Zustand in einen unbesetzten, energetisch tieferen Zustand

Fluoreszenz: die absorbierte Energie wird innerhalb von 10−10 bis 10−7 s
nach der Anregung in Form von Strahlung gleicher, längerer oder kürzerer
Wellenlänge wieder abgeben

Phosphoreszenz: Emissionsprozesse mit längeren Abklingzeitkonstanten
(>10−3 s)

Question 2

Wonach werden Lumineszenzprozesse eingeteilt und welche Arten (7) gibt es?

Answer 2

Nach der Art der Energiezufuhr.
Radiolumineszenz,
Elektrolumineszenz,
Chemilumineszenz,
Biolumineszenz,
Tribolumiszenz, Kristallolumineszenz,
Photolumineszenz

Question 3

Was ist Intersystem crossing?

Answer 3

photophysikalischer Prozeß, der den
strahlungslosen Übergang zwischen zwei elektronischen Zuständen
verschiedener Multiplizität, z. B. S1 → T1, T1 → S
0 beschreibt, bei dem es
zu einer Spinumkehr kommt

Question 4

Was ist innere Konversion/internal conversion?

Answer 4

Strahlungsloser Übergang zwischen zwei elektronischen Zuständen der gleichen Multiplizität.

Question 5

Welche Messgeräte werden in der Fluorometrie benutzt?

Answer 5

Geräte:

• Filterfluorimeter
• Fluorospektralphotometer

Question 6

Welche Messparameter gibt es in der Fluorimetrie und wie werden sie berechnet?

Answer 6

Floureszenz-Quantenausbeute (Phi) = Zahl der ausgestrahlten Quanten / Zahl der eingestrahlten Quanten

Intensität Q der Fluoreszenzemission: Q=I_0(2,303εcd)*(Phi)

Question 7

Welche Nachweisgrenze gibt es in der Fluorometrie?

Answer 7

bis zu 10^-12 Mol

vgl. Absorptionsanalyse: 10^-8 Mol

Question 8

Wo liegt der Linearitätsbereich bei der Fluorometrie? (Formel)

Answer 8

c < oder = 0,05/(ε*d)

ε molarer Absorptionskoeffizient

Question 9

Was sollte bei der Fluorometrie vermieden werden?

Answer 9

Die Reabsorption des emittierten Lichtes.

Question 10

Was ist Quenching und was sind Gründe dafür?

Answer 10

Quenching/Fluoreszenzlöschung:
• Die Aussendung von Fluoreszenzlichtquanten kann infolge
Fluoreszenzlöschung ausbleiben, wenn die Anregungsenergie z. B.
- durch Stöße mit anderen Molekülen “verlorengeht” (strahlungslose
Desaktivierung, Konzentrationslöschung)
- als elektronische Energie auf andere, als Fluoreszenzlöscher, ggf. aber auch
als sog. Fluoreszenzverstärker wirksame Moleküle übertragen wird
(sensibilisierte Fluoreszenz, auch verzögerte Fluoreszenz)
- (nach vorausgegangenem sog. intersystem crossing) in ein langlebiges
(“metastabiles”) Niveau übergeht und dann als Phosphoreszenzlichtquant
abgestrahlt wird.

Question 11

Was bezeichnet Immunofluoreszenz und wozu dient sie?

Answer 11

• Fluoreszenzfähige Moleküle (Fluorochrome) werden als
Fluoreszenzsonden (engl. fluorescent probes) zur spezifischen Markierung
in der Immunologie verwendet
- sekundärer Fluoreszenz: Fluoreszenz wird vom Fluorochrom “mitgebracht“
- Fluorogene (Fluorophore) dienen zur Untersuchung von Enzymen und
Proteinen
- z.B. Enzymimmunoassays (ELISA)

Question 12

Was sind Fluorochrome?

Answer 12

Fluoreszenzfähige Moleküle

Question 13

Was sind Flourophore?

Answer 13

Physikalische Systeme, bei denen Fluoreszenz auftritt, heißen Fluorophore

Question 14

Was ist der Förster-Energietransfer bzw. Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET)?

(engl. fluorescence resonance energy tranfer)

Answer 14

• Bezeichnung für den effektiven Energietransfer (ohne Emission von
Strahlung) von einem elektronisch angeregten Fluoreszenzfarbstoff als
Donor auf ein benachbartes Akzeptormolekül im Grundzustand (siehe
Quenching).
-> Dabei wird die Abnahme der Fluoreszenz des Donors und
gegebenenfalls die Fluoreszenz des Akzeptors beobachtet.

Question 15

Welche Voraussetzung muss für den FRET erfüllt sein und wo wird der FRET angewandt?

Answer 15

• Voraussetzung: Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit
dem Absorptionsspektrum des Akzeptors.
• Anwendung: Ermittlung von nahe benachbarten Regionen in
Biomolekülen (nm-Bereich)
- Licht im Bereich der Absorptionsfrequenz des Donors einstrahlen
- Emissionsfrequenz des Akzeptors detektieren

Über FRET lassen sich mehrere Abstände innerhalb eines Moleküls oder zwischen zwei Molekülen
vermessen. Die grauen bzw. schwarzen Punkte stellen im Bild jeweils die mittlere Position eines
an unterschiedliche Basen angebundenen Donor- bzw. Akzeptorfluorophors dar. In die
gemessenen Abstände lassen sich dann Strukturen, hier zum Beispiel zwei Helixarme,
hineinmodellieren, um so deren räumliche Anordnung zu bestimmen.

Question 16

Worin unterscheiden sich UV- und Floureszenzspektroskopie?

Answer 16

UV:
• Bestimmung der Absorption
(Lichtanteil I, der nicht
absorbiert wurde): indirekte
Meßmethode
• Referenzprobe möglich
• Differenzbildung erforderlich:
2-3 Größenordnungen weniger
empfindlich als
Fluoreszenzmessungen
• Meßparameter: Extinktion E

Fluoreszenz:
• Fluoreszenz
• Bestimmung der Emission:
direkte Meßmethode
• Korrektur aufgrund fehlender
Referenz schwieriger
• Vergleichsweise großer
absoluter Fehler (Wellenlänge
\+ 5 nm, Signalgröße + 10 %)
• Meßparameter:
Quantenausbeute
(Phi);
Reichweite R für
strahlungslosen
Energietransfer, Lebensdauer
, Polarsation p, Anisotropie r,
Stokessche Verschiebung (delta Lambda)