Föreläsning 4 Flashcards
SEC, IEX (39 cards)
Vad är SEC & vad baseras det på?
Size Exclusion Chromatography. Separation med avseende på storlek & form. Ingen fysisk separation, baseras endast på att molekyler tar olika vägar genom matrisen beroende på storlek & form.
Hur ska matrisen vara för SEC?
Vad kan man tillsätta matrisen?
Man vill ha en matris av kulor med porer så att vissa molekyler går in i kulorna och vissa går runt.
Matrisen ska EJ gynna inbindning av protein, ska endast åka igenom.
Matrisen kläs med OH-grupper för att få hydrofilt så vatten kan pumpas igenom.
På vilket sätt påverkar bufferten SEC?
Bufferten påverkar EJ separationen.
Vilken påladdningsvolym vill man ha vid SEC?
Liten volym, är volymen för stor startar molekylerna ej samtidigt och separationen kommer ej stämma.
Hur kommer kromatogram för SEC att se ut?
Större molekyler som går runt kulor kommer ut efter ca 1/3 av volymen av kolonnen (void volym, v0).
Mindre som går in i kulorna kommer ut efter ca 2/3 av volymen (vi).
Elueringsvolym/retentionsvolym (ve, vR) är volymen det tar innan det man söker kommer ut.
Vad är distributionskoefficienten?
Distributionskoefficienten kD säger om man kan separera. Måste ha nog stor skillnad på värdena.
Kd = (Vr-V0)/Vi
Vi = vt-v0-vmatrix = por-volym.
Vad är exclusional limit?
Minsta storlek som INTE kommer in i porerna. Dessa molekyler går runt kulorna och kan ej separeras.
Vad är fractionation rate?
Storlekar som går in i porer.
Vad är inclusion limit?
Största som går in i alla porer går ej att separera från de mindre som också går in i porer.
Hur påverkar molekylernas form separationen (SEC)?
Den hydrodynamiska radien beror av form. En avlång molekyl tar upp mer plats vid rörelse och verkar som en större molekyl pga sin form. Separationen påverkas alltså inte bara av storleken utan även av formen.
Vilka användningsområden finns för SEC?
Fraktionering av protein (separation).
Buffertbyte (större än saltmolekyler i buffert kan separeras bort).
Analys av storlek.
Vad är fraktionering?
Separation, främst av stora kontaminanter i void. Kräver liten startvolym, anpassa & ha bred kolonn. Ladda provvolym 1-5% av kolonnvolym.
Vilken storleksskillnad kräver fraktionering?
Ca 30%.
Varför är fraktionering (SEC) inte bra som ett första reningssteg?
För att man har mycket volym i början och det klarar SEC inte av. Efter vt kan man dock ladda nytt, kör så långt att nya volymen ej hinner ikapp gamla.
Hur fungerar avsaltning/buffertbyte mha SEC?
Små molekyler som salter fastnar i mikroporer i matrisen. Större som protein passerar mellan och elueras snabbare. Man laddar provvolym 30% av kolonnvolym. Kan ske mha gravitation, flöde eller centrifugering.
Hur fungerar analys av storlek mha SEC?
Kalibrera kromatogram med molekyler av liknande storlek, ladda på prov och kolla likheter.
OBS. De kan ha samma storlek men olika form!
Vad är unikt med SEC?
- Lägst upplösning.
- Lägst kapacitet.
- Späder ut prov.
+ Separerar multimerer (går ej via annat pga samma laddning etc.).
+ Separerar aggregat.
Vad är jonbyte?
Har matris med laddningar, omgiven av motjoner från buffert. Proteiner med motsatt laddning till matris byter plats med motjoner.
Hur eluerar man från jonbyte?
Svagt laddade molekyler tvättas bort med motionerna men de starka binder och elueras sedan med mycket motioner.
Hur återställer man matris vid jonbyte?
Med lagom mycket motjoner.
Vad kan påverka laddningen under jonbyte?
Omgivningen, hur mycket H+ det finns i buffert ex.
Vad är pI?
Hur påverkar detta proteiner?
Isoelektrisk punkt, där nettoladdningen är noll. Antal plus = antal minus.
Basiska är mest positiva vid högt pH (ovanligt med pI>9).
Sura är med negativa vid lågt pH (ovanligt med pI<5).
Sura proteiner är vanligast och de har pI under 7.
Hur väljer man jonbytare?
Beror av proteinets laddning i vald buffert.
Tänk på proteinstabilitet.
pH i omgivning, vill ha pH där protein kan interagera med katjon/anjonbytare.
Kontaminanter ska EJ binda in.
Vid lågt pH har man mycket H+, vid högt har man mycket OH-.
Hur kan man härleda vilken laddning protein får baserat på dess pI och omgivnings pH?
Över pI vid högt pH = neg.
Under pI vid lågt pH = pos.