Föreläsning 6

Question 1

Varför vill två hydrofoba ytor gå ihop?

Answer 1

För att skydda sig mot vatten som lägger sig ordnat kring hydrofoba ytor. Ordnad form är energimässigt ogynnsamt. När två ytor går ihop kan vatten vara oordnat.

Question 2

Vad är tre saker hydrofobicitet är viktigt för?

Answer 2

Proteinveckning.
Protein:protein interaktioner.
Protein:matris interaktioner.

Question 3

Varför associerar opolära molekyler spontant i vattenlösning?

Answer 3

Pga hydrofobicitet. Vill skydda ytorna.

Question 4

Vad är Paulings skala och vilken sida är mest elektronegativ?

Answer 4

FONClBrISCH, mest elektroneg. åt vänster.

Question 5

Vad händer om atomer med olika elektronegativitet bildar en molekyl?

Answer 5

Molekylen blir polär, hydrofil.

Question 6

Vad händer om atomer med liknande elektronegativitet bildar en molekyl?

Answer 6

Molekylen blir opolär, hydrofob.

Question 7

Vad står HIC för?

Answer 7

Hydrophobic Interaction Chromatography

Question 8

Hur vill man ha liganden i HIC? Hydrofob eller hydrofil?

Answer 8

Liganden ska vara hydrofob så vatten kan flöda igenom men inte för hydrofob för då vill inte vattnet.

Question 9

Vad är grundprincipen i HIC, dvs varför binder proteinet till liganden?

Answer 9

Det tvingas till ordnad form längs matrisens hydrofoba ligand & hydrofoba ytor på proteinet. Detta är ogynnat och därför binder proteinet till liganden så att vattnet kan släppas lös.

Question 10

Hur sker adsorptionen i HIC?

Answer 10

Genom interaktioner mellan opolära regioner på proteinets yta och en hydrofob ligand på matris.

Question 11

Varför tillsätter man prov i salt?

Answer 11

För att gynna hydrofobiska interaktioner.

Question 12

Vilka molekyler kan separeras?

Answer 12

De som är hydrofoba separeras från de hydrofila men även molekyler med olika mkt exponerad opolär yta kan separeras.

Question 13

Vilka parametrar påverkar HIC?

Answer 13

Stationär fas:
Matris (typ).
Ligand (typ, densitet).
Mobil fas:
Salt (typ, Konc.)
pH
temperatur
additativ

Question 14

Vilka slags matriser används i HIC? Ge ex. Låga och höga flöden.

Answer 14

Korslänkade kolhydrater för porös struktur. Mjuka, används ej för högt flöde.
Ex. agarose, cellulosa, dextran.
För högre flöden kan silika eller syntetiska polymerer användas.

Question 15

Hur kan man anpassa matrisen så att den fungerar bra för HIC?

Answer 15

Genom att minimera laddningar för att undvika jon-joninteraktioner. Vi vill åt ospecifik inbindning dvs. hydrofoba interaktioner men vill ej ha kvar joner i matrisen.

Question 16

Vilka tre slags ligander kan användas i HIC?

Answer 16

Halvhydrofoba = korta alkankedjor, mild eluering är möjligt.
Aromatiska grupper = starkare interaktion, dock även pi-pi.
Linjära alkaner = ju längre alkan, desto starkare interaktion (4-10st).

Question 17

Hur är det bäst att kombinera HIC med jonbyte?

Answer 17

Genom att köra HIC efter jonbyte. Detta pga att man i jonbyte eluerar med hög salthalt och i HIC har man hög salthalt vid påladdning.

Question 18

Hur eluerar man i HIC?

Answer 18

Genom att minska salthalten. Fungerar det inte kan man tillsätta något opolärt.

Question 19

Vad innebär det att ett salt är kosmotroft?

Answer 19

Att det ökar strukturen hos vatten vilket ger starkare hydrofoba interaktioner.

Question 20

Vad innebär det att ett salt är kaotroft?

Answer 20

Det destrukturerar vatten.

Question 21

Vilket samband finns mellan hydrofobicitet och ökad ytspänning? Finns det undantag?

Answer 21

Om ett salt ökar ytspänning brukar det oftast öka hydrofoba interaktioner.
MgCl2 är ett undantag, det ökar ytspänning men inte hydrofoba interaktioner.

Question 22

Ge exempel på salter som ökar ytspänning och hydrofoba interaktioner?

Answer 22

Natriumsulfat ger väldigt bra inbindning. Kan dock fälla protein, använd ej höga koncentrationer. Vanligast!
Ammoniumsulfat ger bra inbindning men är instabil då det blir ammoniak vid pH > 8.

Question 23

Varför bör fosfatbuffert ej användas vid HIC?

Answer 23

Det är svårt med höga koncentrationer utan fällning och då fosfatjonen blir dubbelprotonerad ger den dålig hydrofobisk interaktion.

Question 24

Hur påverkar temperatur hydrofobicitet? Vad är viktigt att tänka på?

Answer 24

Påverkar hur starka interaktionerna är. Varm temp = starkare. Kall temp = elueras snabbare. OBS tänk på denaturering.

Question 25

Hur påverkar pH hydrofobicitet?

Answer 25

pH påverkar ej hydrofobicitet direkt MEN avgör antal laddningar hos protein (ökar -> hydrofilt & minskar -> hydrofobt). Välj pH för att minska laddningar.

Question 26

Varför skulle man vilja ha additativ i HIC?

Answer 26

Protein kan veckas upp för att det vill vara med matrisen i HIC, detta muckar med strukturen. Då kan man tillsätta något som stabiliserar protein så det ej veckas upp. Kan även underlätta eluering då protein sitter hårt. Ta något opolärt som EtOH, TritonX, ispropanol. Sitter det riktigt hårt, ta lite urea. Kan även tillsätta någon jon som gynnar proteinet.

Question 27

Hur ser CIP ut för HIC?

Answer 27

Det blir en kletig hydrofobisk interaktion till matrisen. Ta bort saltsteget, det förvärrar bara. Ta lut & syra. Kan behöva tillsätta något opolärt för kletet som alkohol, amin eller detergent. Kan även ta ett kaotroft salt som destrukturerar vatten.

Question 28

Vad står RPC för?

Answer 28

Reversed Phase Chromatography

Question 29

Vilka faser har man i RPC?

Answer 29

Mobilfas är polär, ex. H2O. | Stationärfas är opolär och fångar upp opolära molekyler.

Question 30

Hur eluerar man RPC generellt?

Answer 30

Öka graden opoläritet i mobilfas, ex. med acetonitril.

Question 31

Vilket av HIC & RPC laddas med salt? Varför?

Answer 31

HIC laddas med salt, RPC endast med vatten. Detta pga att HIC har mindre hydrofoba bindningar än RPC.

Question 32

Vilken av HIC & RPC har mest hydrofob ligand?

Answer 32

RPC har mest hydrofob ligand.

Question 33

Hur eluerar man i HIC respektive RPC?

Answer 33

``` HIC = vatten/utspädd lösning. Minska salt. RPC = opolärt medel. ```

Question 34

Har man nativt eller reducerat protein i HIC resp. RPC?

Answer 34

``` HIC = nativt. RPC = reducerat. ```

Question 35

Vilket av FPLC och HPLC bör användas för HIC respektive RPC?

Answer 35

``` HIC = FPLC RPC = HPLC ```

Question 36

Vilket av RPC och HIC är tuffast?

Answer 36

RPC

Question 37

Vilka matriser kan användas i RPC? Hur modifieras dessa?

Answer 37

Porösa silika matriser som är mekaniskt och kemiskt stabila. SiOH-grupper används för ligandkoppling men måste hållas under pH 7.5 (annars är SiOH ej hydrofobt). Modifiera för hydrofobicitet, pH... Organiska polymerer som inte är lika mekaniskt stabila. Krymper i vissa lösningsmedel. Behöver ej koppla på ligand, är redan hydrofob. Ex. polystyren.

Question 38

Hur får man silikamatris att bli hydrofobt?

Answer 38

Man kopplar på alkankedjor (2-8 kol). Använder sig av end-capping med kortare ligander för att dölja SiOH-grupper som ej blockerats och är hydrofila.