Ge: section 4

Question 1

Définir bout cohésif vs bout franc.

Answer 1

Bout franc: l’enzyme de restriction à coupé au milieu de la séquence palindromique.

Bout cohésif: L’enzyme ne coupe au même endroit à l’intérieur de la séquence, de sorte que les deux bouts qui en résulte peuvent se recoller avec un autre bout cohésif qui lui est complémentaire.

Question 2

Définir isoschizomère.

Answer 2

Isoschizomère est un terme qu’on applique à un groupe d’enzymes qui ont le même site de restriction, mais qui sont de souches bactériennes différents (ils ont donc pas le même nom).

Question 3

Qu’est-ce que l’on entend par enzymes de restriction compatible?

Answer 3

Des enzymes qui génèrent des bouts cohésifs complémentaires, qui peuvent donc se réunir ensemble. (pas le même site de restriction)

Question 4

Quelle est la fonction de ces enzymes: 
DNase, 
RNase, 
ligase, 
phosphatase, 
ADN polymérase, 
reverse transcriptase?

Answer 4

DNase: Enzyme qui coupe les 2 brins de l’ADN au hasard.

RNase: activité exo- et endonucléase, coupe l’ARN (enzyme non spécifique)

Ligase: Favorise la formation d’une liaison entre 2 fragments d’ADN

Phosphatase: Catalyse l’élimination d’un groupe Phosphate en 5’ d’un fragment d’ADN pour éviter qu’il se referme sur lui-même.

ADN polymérase: Synthétise de l’ADN à partir d’une matrice ou d’une copie d’ADN. (Sont ADN dépendantes)

Reverse transcriptase: Catalyse la formation d’ADNc à partir d’un ARNm.

Question 5

Que signifie le terme vecteur en biologie moléculaire?

Answer 5

Un vecteur est de l’ADN dans lequel on insert un fragment d’ADN que l’on veut étudier.

Question 6

Pourquoi différents vecteurs sont utilisés en biologie moléculaire?

Answer 6

On utilise différents vecteurs pour pouvoir intégrer des fragments d’ADN de différentes grosseur.

Question 7

Expliquer ce qu’on entend par le “cycle lytique” du phage lambda

Answer 7

C’est un des deux cycles par lequel le phage lambda se multiplie. Pendant ce cycle, le phage se multiplie à l’intérieur de la bactérie, et les nouveaux phages qui en sont formés sortent en lysant la bactérie.

Question 8

Nommez 2 types de phages utilisés au labo?

Answer 8

Le phage lambda

Le phage M13

Question 9

Lors de la réplication (multiplication) des phages, expliquez 2 façons mentionnées au cours et labos par lesquelles les phages peuvent infecter les bactéries et nommez 2 façons dont les phages peuvent sortir de la bactérie.

Answer 9

Infecter:

1. entrée via le pilus sexuel mâle (comme le M13)
2. entrée par les récepteurs à maltose

Sortie:

1. Par bourgeonnement (ne détruit pas la bactérie)
2. Par lyse de la bactérie

Question 10

Sur un plasmide ou phagémide que signifie la région “Ori”, quelle est sa fonction?

Answer 10

Ori = origine de réplication
Fonction: Reconnait une protéine bactérienne qui contrôle le nombre de copies de plasmides par bactérie. Est modifié en labo pour que le plasmide se réplique sans le contrôle exercé par la bactérie.

Question 11

• Sur un phagémide que signifie la région “f1”, quelle est sa fonction? (p. 18)

Answer 11

Origine de réplication simple brin du phage f1

Question 12

Quel est le rôle du site de clonage multiple dans un vecteur?

Answer 12

Contenir un éventail de zones de restrictions uniques (tous différentes et n’existant pas ailleurs sur le vecteur) à l’intérieur du gène Lac Z codant pour la sous-unité alpha de la protéine beta-galactosidase.

Question 13

Pourquoi a-t-on positionné le site de clonage multiple dans la sous-unité alpha de la beta-galactosidase?

Answer 13

Pour que lorsqu’on introduit de l’ADN étranger à cet endroit, le gène lac Z qui code pour la sous-unité alpha du BGal soit détruit. Résultat: pas de BGal fonctionnelle, pas de réaction d’alpha-complémentation (bactéries blanches).

Question 14

Comment peut-on estimer le nombre de bactéries dans un bouillon de culture?

Answer 14

En mesurant la densité optique (D.O.) à une longueur d’onde de 600nm.
1 D.O. = 800 x 10 6 bactéries/ml

Question 15

• Expliquer ce qui se passe lorsque vous ensemencez un bouillon de culture bactérienne à l’aide d’une colonie de bactéries? (En d’autre mots définir dans le temps la croissance bactérienne en fonction de la densité optique, quels sont les phases rencontrées?). (4)

Answer 15

1. Phase de latence (bactéries synthétisent protéines pour utiliser les nutriments)
2. Croissance exponentielle
3. Phase stationnaire (conditions non-optimales, meurent au même rythme qu’elles se divisent)
4. Phase de mort cellulaire

Question 16

• Définir infection vs transformation vs transfection.

Answer 16

Infection: Le virus (le phage) entre dans la bactérie
Transformation: l’ADN d’intérêt (sous forme de plasmide) est inséré dans la bactérie
Transfection: Insertion de l’ADN dans des cellules eucaryotes en culture in-vitro.

Question 17

• Lorsque l’on souhaite réaliser une purification d’ADN plasmidique (mini-prep), nommez les grandes étapes (3) de cette technique de purification.

Answer 17

1. Lyse bactérienne (détergent + NaOH)
2. Précipiter les protéines et l’ADN génomique
3. Recueillir l’ADN plasmidique en suspension (purification ou centrifugation)

Question 18

Lors de la mini-prep quel est le rôle de la solution de NaOH + SDS?

Answer 18

Lyser les bactéries (solubiliser les membranes)

Question 19

Lors de la mini-prep quel est le rôle de la solution d’acétate de potassium?

Answer 19

Reformer les ponts H pour précipiter les protéines et l’ADN génomique

Question 20

Sur quelle base peut-on sélectionner les bactéries qui ont été infectées (ou transformées) par un plasmide (ou phagémide)?

Answer 20

Résistance antibiotique (grâce au gène présent dans le plasmide)

Question 21

Définir le mode d’action de l’Ampicilline? Et du gène de résistance à celle-ci.

Answer 21

L’ampiciline empêche l’action de la transpeptidase dans la formation de la paroi bactérienne puisque l’enzyme reconnait sa structure B-Lactam et s’y fixe de façon irréversible.

Le gène de résistance code pour la protéine B-lactamase qui clive le cycle B-lactam de l’ampiciline.

Question 22

Définir le mode d’action de la Kanamycine? Et du gène de résistance à celle-ci.

Answer 22

La kanamycine bloque la synthèse protéiqueben se fixant sur le ribosome.

Le gène de résistance code pour la protéine pKan, une phosphotransférase qui ajoute des groupes phosphates à la kanamycine. Une fois phosphorylée, elle ne peut plus se lier aux ribosomes.

Question 23

Vous devez insérez dans un plasmide un fragment d’ADN. Quelles séries d’enzymes devrez-vous utiliser?

Answer 23

1. Enzymes de restriction
2. Phosphatase
3. Ligase

Question 24

De quelle façon peut-on sélectionner un plasmide recombinant d’un plasmide non recombinant qui a servi à transformer une bactérie?

Answer 24

Système de sélection visuelle par coloration avec la réaction d’alpha-complémentation, basé sur l’expression/formation de la protéine beta-galactosidase. (Bactéries bleues = non recombinant, blanches = recombiant)

Nécessite de l’IPTG (inactive le répresseur) et du X-Gal (substrat qui devient bleu lorsque clivé par la beta-galactosidase)

Question 25

Qu’est-ce qu’une génothèque d’ADN génomique?

Answer 25

Un ensemble de vecteurs recombinants contenant chacun un morceau différent du génome de l’espèce étudiée.

Question 26

Pour un individu donné, combien de génothèque d’ADN génomique existe-il?

Answer 26

1

Question 27

Qu’est-ce qu’une génothèque d’ADN complémentaire (ADNc)?

Answer 27

Une représentation des populations d’ARNm présents dans un tissu donné à un stade déterminé. (donc aussi des gènes exprimés dans ce tissu)

Question 28

• Combien de génothèque d’ADNc existe pour un individu donné et pourquoi?

Answer 28

Il en existe plusieurs, car les populations d’ARNm varient d’un organe et même d’un tissu à l’autre. Une banque d’ADNc est donc spécifique d’un tissu.

Question 29

Pourquoi ne pas travailler directement avec les ARNm?

Answer 29

Car ils sont beaucoup moins stables, et donc difficile à manipuler.

Question 30

Quel est l’objectif de cribler une génothèque d’ADN complémentaire?

Answer 30

De rechercher un fragment spécifique d’ADN qui est cloné dans le vecteur parmi des milliers de clones